不同品种桑葚叶总酚含量及其抗氧化活性比较

马飞跃　耿炬　乔健　帅希祥　张明　杜丽清

摘  要：为了研究不同品种桑葚叶的总酚含量差异及应用价值，以收集引种的40个品种桑葚叶为研究对象，采用超声波辅助提取桑葚叶中酚类物质，以总酚提取率为指标，利用单因素试验和正交试验考察各因素对超声辅助提取桑葚叶总酚提取率的影响;采用DPPH自由基清除能力评价不同品种桑葚叶提取物的抗氧化能力，同时对不同品种桑葚叶中总酚含量及其抗氧化能力进行相关性分析。结果表明：超声辅助提取桑葚叶总酚的最佳工艺条件为：超声温度65 ℃、超声时间30 min、固液比1∶45（g/mL）、乙醇浓度60%，4个因素对桑葚葉总酚提取率影响大小顺序为：超声温度>超声时间>固液比>乙醇浓度。不同品种桑葚叶总酚含量差异较大，其中‘条桑五号总酚含量最高，为（26.35 ± 0.29）mg/g，‘滇桑总酚含量最低，为（20.44 ± 0.15）mg/g;不同品种桑葚叶抗氧化活性也存在差异，且趋势与总酚含量基本一致，‘条桑五号桑葚叶抗氧化活性最强，清除DPPH自由基能力IC50为（77.64 ± 0.34）mg/L，总抗氧化能力（FRAP）TEAC值为（2.58 ± 0.11）mmol/g;‘滇桑桑葚叶抗氧化活性最弱，清除DPPH自由基能力IC50为（210.30 ± 0.19）mg/L，总抗氧化能力（FRAP）TEAC值为（0.73 ± 0.04）mmol/g。桑葚叶总酚含量与其提取物抗氧化能力呈正相关，选择总酚含量高的桑葚品种栽培，可提高桑葚的综合附加值。

关键词：不同品种桑葚叶;总酚;抗氧化

中图分类号：Q949.9;S663.9      文献标识码：A

Comparison of Total Phenol Content and Antioxidant Activity from Different Mulberry Leaves

MA Feiyue， GENG Ju， QIAO Jian， SHUAI Xixiang， ZHANG Ming， DU Liqing*

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： In order to compare the contents of total phenol in different mulberry leaves and the different application， single-factor experiments and a four-variable， three-level orthogonal array design were performed to study on the extraction of total phenols from 40 mulberry leaves. The optimal conditions were： temperature 65 ℃， time 30 min， solid/liquid ratio 1∶45 （g/mL）， and ethanol concentration 60%. The effect of extraction condition were temperature > time > solid/ liquid ratio > ethanol concentration. Under the optimal conditions， the highest content of total phenol in ‘Tiaosang 5 mulberry leaves was （26.35 ± 0.29） mg/g. The least content of total phenol in ‘Diansang mulberry leaves was （20.44 ± 0.15） mg/g. Furthermore， the most antioxidant activity of the extracts from ‘Tiaosang 5 mulberry leaves and lowest one from ‘Diansang mulberry leaves was （77.64 ± 0.34） mg/L and （210.30 ± 0.19） mg/L （IC50）， respectively， according to the DPPH radical-scavenging assay. According to the FRAP， TEAC of ‘Tiaosang 5 mulberry leaves and ‘Diansang mulberry leaves was （2.58 ± 0.11） mmol/g and （0.73 ± 0.04） mmol/g， respectively. The total phenol content was positively correlated with the capacity of DPPH radical scavenging. Choosing varieties with high total phenol content in mulberry leaves could improve the economic values of mulberry.

Keywords： different mulberry leaves; total phenol; antioxidant activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.039

桑葚（Folium Mori），桑科落叶灌木或小乔木植物，别名家桑、荆桑、桑葚树、黄桑叶、桑枣树等[1-3]。全球50%的国家种植桑树，主要分布于中国、韩国及日本等国家，而我国是最大的桑树种植国。桑葚叶是桑树的主要产物、蚕的日常食物，产量丰富[4]。完整叶片呈卵形、宽卵形、心形、圆状形等，单叶互生，上表面无毛，有光泽，下表面绿色，脉上有疏毛[5]。桑葚叶营养成分非常丰富，主要成分有黄酮类、生物碱、植物甾醇、-氨基丁酸、桑叶多糖等[4， 6-9]。桑葚叶中的营养成分随桑葚品种、采收时间、产地等有明显不同。桑葚叶具有抗衰老、抗疲劳、抗病毒、抗肿瘤、抑菌、抗炎、降血脂、降胆固醇、降血压等药用价值[10-12]，同时具有养颜、美容之功效。在中国就有桑叶制茶的历史，誉为“神仙茶”，而在日本则被称为“长壽茶”[13-14]。

每年为果实增产而进行短截修枝而产生大量桑葚叶，桑葚叶占桑园年产干物质量的36%左右[13]。桑叶虽主要用于传统的养蚕业和制茶业，但供大于求，造成严重资源浪费[15]，如何充分利用桑葚产业的副产品，为农民增产增收，实现产业化可持续发展是现阶段的关键问题。而目前为响应国家政策，以可持续发展为战略目标，以采摘、亲子游等形式的休闲农业蓬勃发展，桑葚作为主要模式果树品种，其品种繁多，且多数研究主要集中在不同品种果实品质评价和比较方面，甚少关于不同品种间桑葚叶活性成分含量差异比较、抗氧化活性差异比较的研究，忽视了桑葚叶的价值，大大降低了其综合附加值。因此对桑葚叶全面、高效地开发和利用，进一步发掘其经济附加值是急需解决的重要问题之一。

为了比较品种间桑葚叶活性成分含量与抗氧化活性的差异，本试验以超声波辅助提取法提取不同品种桑葚叶中的总酚，并优化其提取条件;采用清除DPPH自由基测定方法对桑葚叶提取物抗氧化能力进行评价;比较不同品种桑葚叶总酚含量和抗氧化能力，为桑葚叶资源的进一步开发利用，增加桑葚综合附加值提供数据支持，并对桑葚深加工产业发展提供理论指导，为桑葚品种栽培开辟了新的思路。

1  材料与方法

1.1  材料

原料：40种不同品种桑葚叶，采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所桑葚种植基地。品种名称及编号见表1。

试剂：DPPH，购自Sigma公司;维生素C（>99.0%），河北源创生物科技有限公司;没食子酸，国药集团化学试剂有限公司;福林酚（1 mol/L），源叶生物;其他试剂均为分析纯。

仪器设备：高速药材调料粉碎机，FZ-06，浙江温岭市百乐粉碎设备厂;旋转蒸发仪，Heidolph Hei-VAP Preciscion，德国海道尔夫公司;纯水仪，RODI-220A1，厦门锐思捷水纯化技术有限公司;酶联免疫分析仪，Spark 10M，帝肯（上海）贸易有限公司;超声波提取仪，SK5210HP，上海科导超声仪器有限公司;台式高速冷冻离心机，MULTIFUGEXIR，美国Thermo公司。

1.2  方法

1.2.1  样品溶液的制备  分别摘取40种不同品种桑葚叶，准确称取每个品种的鲜重，在干燥箱中（50 ℃）将其烘干至重量恒定，用粉碎机将其粉碎，密封保存于冰箱作为待测品。准确称取1.0 g待测品至锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，密封瓶口，在不同提取温度、乙醇浓度、时间、固液比条件下进行提取，再过滤，得到上清液，重复提取3次，合并上清液。用旋转蒸发仪蒸干溶剂，称取质量，再溶解定容至10 mL。

1.2.2  提取方法 （1）超声波辅助提取方法。选择广泛种植的品种‘大十，作为优化提取工艺的材料。准确称取1.0 g‘大十桑葚叶至锥形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇溶液，锥形瓶用封口膜封口，在30 ℃超声提取20 min。过滤取上清液，重复提取3次。用旋转蒸发仪蒸干溶剂，称量，再溶解定容至10 mL，测定其中总酚含量，计算提取率。

（2）传统提取方法。准确称取1.0 g‘大十桑葚叶至锥形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇溶液，锥形瓶用封口膜封口，在30 ℃水浴中提取20 min，提取结束后操作同上。

1.2.3  桑葚叶总酚提取的单因素实验  （1）乙醇浓度对桑葚叶总酚提取率的影响。准确称取1.0 g‘大十桑葚叶至锥形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入不同浓度（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇溶液，锥形瓶用封口膜封口，在30 ℃超声提取20 min。过滤取上清液，重复提取3次。用旋转蒸发仪蒸干溶剂，称量，再溶解定容至10 mL，测定其中总酚含量，计算提取率。

（2）超声温度对桑葚叶总酚提取率的影响。准确称取1.0 g‘大十桑葚叶至锥形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入60%的乙醇溶液，锥形瓶用封口膜封口，在不同超声温度（30、40、50、60、70 ℃）下超声提取20 min。过滤取上清液，重复提取3次。用旋转蒸发仪蒸干溶剂，称量，再溶解定容至10 mL，测定其中总酚含量，计算提取率。

（3）超声时间对桑葚叶总酚提取率的影响。准确称取1.0 g‘大十桑葚叶至锥形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，锥形瓶用封口膜封口，在60 ℃下超声提取不同时间（20、30、40、50、60、70 min）。过滤取上清液，重复提取3次。用旋转蒸发仪蒸干溶剂，称量，再溶解定容至10 mL，测定其中总酚含量，计算提取率。

（4）固液比对桑葚叶总酚提取率的影响。准确称取1.0 g不同品种的桑葚叶至锥形瓶中，按不同固液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]加入60%乙醇溶液，锥形瓶用封口膜封口，在60 ℃超声提取30 min。过滤取上清液，重复提取3次。用旋转蒸发仪蒸干溶剂，称量，再溶解定容至10 mL，测定其中总酚含量，计算提取率。

1.2.4  桑葚叶总酚提取的正交实验  在单因素实验基础上，进行L9（34）四因素三水平正交试验，以获得超声辅助提取桑葚叶总酚最佳工艺条件。因素水平表见表2。

1.2.5  总酚含量测定  （1）标准曲线绘制。精密称取没食子酸，溶于水中，配制成浓度为50、100、150、250、500、1000 mg/L的没食子酸标准品溶液。采用福林酚法[16]测定总酚，略作修改：分别移取0.20 mL不同浓度的标准溶液，再分别加入1.00 mL福林酚试剂（0.1 mol/L）和0.80 mL纯水，混匀，静置5 min，然后加入1.00 mL Na2CO3溶液（7.5%），充分混匀。避光反应2 h，在765 nm处测定吸光度。以没食子酸浓度作为横坐标（X），吸光度作为纵坐标（Y），制作标准曲线：Y=2078.9X-122.21（R2=0.998）。

（2）样品中总酚含量测定。准确吸取定容后的桑葚叶提取液0.20 mL，按上述方法操作，在765 nm下测定吸光度，并根据标准曲线计算桑葚叶总酚提取率。桑葚叶中总酚提取率和不同品种桑葚叶总酚含量计算公式：总酚提取率= 100%× CV/M;不同品种桑葚叶总酚含量（mg/g）= CV/M。其中，C为经标准曲线计算得样品总酚含量，mg/L;V为定容的体积，L;M为称取桑葚叶的质量，g。

1.2.6  抗氧化活性测定方法  （1）DPPH清除能力测定。准确移取按照1.2.1制备的样品溶液各0.1 mL，其具体操作参考Ma等[17]的方法。对不同品种的桑葚叶提取物进行（清除DPPH自由基能力）抗氧化活性测定，每个样品重复3次。以VC作为对照。

（2）总抗氧化能力（FRAP法）测定。准确移取按照1.2.1制备的样品溶液，与200 μL FRAP工作液（按照试剂盒操作步骤配置）混合均匀后，在37 ℃水浴条件下孵育5 min，之后在517 nm下进行检测。每个样品平行重复3次。具体操作方法和计算公式均参照碧云天试剂盒方法[总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法）]进行。

1.3  数据处理

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析，采用Origin 8.0软件对分析后的实验数据进行作图。

2  结果和分析

2.1  提取方法對桑葚叶总酚提取率的影响

由图1可知，在相同的提取条件下，与传统提取方法相比，超声波辅助提取法所得桑葚叶总酚提取率显著提高（P<0.05）。这可能是因为超声波的强大剪切力可以破坏桑葚叶的细胞结构，从而增加目标化合物的溶出，且超声波辅助也可增加目标化合物的溶解速度，增强扩散传质，因此导致桑葚叶总酚的提取率增加。故选择超声波辅助提取法作为桑葚叶总酚提取的方法。

2.2  超声辅助提取桑葚叶总酚工艺优化单因素实验

2.2.1  乙醇浓度对桑葚叶总酚提取率的影响  从图2可知，桑葚叶总酚提取率随乙醇浓度增大呈现先增加后略降低的趋势，乙醇浓度为0～50%时，桑葚叶总酚提取率逐步增加，在乙醇浓度为60%～80%时，总酚提取率总体差异不显著，基本保持不变，在>80%后，略有降低。一方面可能是由于溶液的介质常数随着乙醇浓度的不断增加而减少，这使得传质所需的能量减少，溶质分子更易进入溶剂，且溶剂极性与多酚物质极性相似度增加，增加了多酚物质的溶解度;另一方面，水能使植物细胞的膨胀增强，又增大了材料与溶剂的接触面积，更易破坏植物细胞。同时，多酚的活性官能团羟基较易与水以氢键结合，而其他基团既可以溶于水又可被乙醇提取。因此，适当比例水的存在可以促进目标化合物提取率的增加[18-20]。综上所述，从经济层面上考虑，选择乙醇浓度55%、60%、65%作为正交试验中乙醇浓度的因素水平。

2.2.2  超声温度对桑葚叶总酚提取率的影响  从图3可知，总酚提取率随温度升高呈现先增加再达到平稳的趋势，在超声温度30～50 ℃时桑葚叶总酚提取率逐步增加，在温度>60 ℃时，总酚提取率基本保持一致。这可能是因为温度升高对桑葚叶总酚的溶出传质起到了促进的作用，桑葚叶总酚提取率随着温度的升高而增加[21]，而当温度达到了临界值时，则不会继续升高。因此，超声温度选择55、60、65 ℃作为正交试验中超声温度的因素水平。

2.2.3  超声时间对桑葚叶总酚提取率的影响  从图4可知，在10～30 min内，桑葚叶总酚提取率随着超声时间的延长而增加，当超声时间继续延长时，其提取率略有下降，但变化差异不明显。这可能是因为，开始时随着超声时间变长桑葚叶总酚物质不断被溶出，当达到一定时间后桑葚叶中总酚物质被基本溶出，即使再增加提取时间也不能达到明显的提取效果，同时提取时间过长有可能会因为超声波的机械剪切力而破坏掉多酚的结构（>40 min）[22]。这一结果与杨上莺等[20]的研究结果相近，同样也优于用溶剂浸提法[23]的最优条件（2 h）。因此，综合考虑，选择25、30、35 min作为正交试验中超声时间的因素水平。

2.2.4  固液比对桑葚叶总酚提取率的影响  从图5可见，桑葚叶总酚提取率随固液比的增加而增加。在固液比为1∶20～1∶40（g/mL）时桑葚叶总酚提取率逐步增加，并在固液比为1∶40（g/mL）时达到最大，之后随着固液比的继续增加，桑葚叶总酚的提取率略有下降，但变化差异不显著。这可能是因为随着溶剂用量的增大，细胞内外的目标物质浓度差不断提高，使得桑葚叶中总酚的传质驱动力增大，从而提高提取率。该结果与杨上莺等[20]和丁双华等[23]的研究结果相似，因此，从节省溶剂消耗，降低提取成本角度考虑，选择1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）的固液比作为正交试验中固液比的因素水平。

2.3  桑葚叶总酚提取正交实验结果

根据以上单因素实验结果，以桑葚叶总酚提取率为指标，选择超声温度（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）、固液比（D）共4个因素进行L9（34）正交实验优化，确定超声辅助提取桑葚叶总酚的最佳提取条件，正交实验结果及方差分析分別见表3和表4。

由表3极差分析和表4方差分析得出影响桑葚叶总酚提取率的主次因素依次为：提取温度>提取时间>固液比>乙醇浓度。同时，由表3极差分析可知，最佳提取工艺条件为：A3B2C2D3，即超声温度为65 ℃、乙醇浓度为60%、超声时间为30 min、固液比为1∶45（g/mL）。最佳提取工艺条件不在正交实验表内，需进行验证实验。以最佳条件为A3B2C2D3对桑葚叶总酚进行提取，进行3次重复实验，提取率为2.30% ± 0.043%。再以最佳条件做加样回收率实验，在提取前加入一定量的没食子酸（表5），计算平均回收率为98.93%，结果表明方法准确度良好。

2.4  不同品种桑葚叶中总酚含量及抗氧化活性的比较

2.4.1  不同品种桑葚叶总酚含量的比较  以2.3优化的桑葚叶总酚提取的最佳工艺条件，对40种不同品种桑葚叶总酚进行提取，并测定总酚含量。从图6可知，不同品种桑葚叶之间总酚含量差异较大。其中‘条桑五号总酚含量最高为（26.35 ± 0.29）mg/g，‘滇桑总酚含量最低为（20.44 ± 0.15）mg/g，该结果范围与其他研究结果一致[24-27]。其中红果系列，条桑系列，杂交品种‘果桑8632以及一些叶果两用品种（如白玉王）其总酚含量较高。而适宜南方种植，抗病性较强，且在广东省内湛江市等地广泛种植的品种‘大十，虽然叶片较大，产量较高，但其总酚含量则处于40种桑葚品种的中下水平。

2.4.2  不同品种桑葚叶提取物抗氧化活性比较  （1）DPPH清除能力。不同品种桑葚叶提取物对DPPH自由基清除能力以IC50表示，由图7可知，‘条桑五号桑葚叶的IC50最低，为（77.64 ± 0.34）mg/L，‘滇桑桑葚叶的IC50最高，为（210.30 ± 0.19）mg/L。IC50值越小，其抗氧化能力越强，因此，‘条桑五号桑葚叶提取物的抗氧化能力最强，且还略强于Vc [IC50 值为（81.62 ± 0.12）mg/L]。其他品种桑葚叶的抗氧化能力与总酚含量趋势基本保持一致。桑葚叶总酚含量与其提取物抗氧化能力呈正相关（相关系数为0.957，P<0.01），总酚含量越高，其抗氧化能力越强，尤其‘条桑五号桑葚叶提取物可开发用作天然抗氧化剂。可见，不同品种桑葚叶提取物抗氧化活性虽然差异较大，但整体均具有较强的抗氧化能力，同时一些品种尤为突出，与高欣妍等[28]的研究结果相近。

（2）总抗氧化能力（FRAP）。用TEAC值，即FeSO4当量来表示不同品种桑葚叶总抗氧化能力。由图8可知，‘条桑五号桑葚叶的TEAC最高，为（2.58 ± 0.11）mmol/g，‘滇桑桑葚叶的最低，为（0.73 ± 0.04）mmol/g，因此，‘条桑五号桑葚叶提取物的抗氧化能力最强。总体趋势与清除DPPH自由基抗氧化能力以及总酚含量趋势基本保持一致。桑葚叶总酚含量与其提取物总抗氧化能力（FRAP）呈正相关（相关系数为0.992，P<0.01）。

3  讨论

本研究利用超声波辅助提取方法，在单因素实验的基础上，通过正交实验进一步对‘大十品种桑葚叶总酚提取工艺进行优化，其最佳工艺条件为：超声温度65 ℃、乙醇浓度60%、超声时间30 min、固液比1∶45（g/mL），且各因素对桑葚叶总酚提取率的影响次序为：超声温度>超声时间>固液比>乙醇浓度，在此条件下，桑葚叶总酚的提取率为2.30% ± 0.043%。与丁双华等[23]、刘咏等[29]和沈维治等[30]采用溶剂浸提法提取桑葚叶多酚工艺相比，明显缩短了提取时间，且提取率更高;张宇思等[27]对超声波提取桑葚叶中活性成分的研究也发现，与传统提取方法相比，超声波提取技术具有提取时间短，操作方便，提取效率高等优点。同时，采用该方法对40个品种桑葚叶中酚类化合物进行提取，并比较不同品种的总酚含量。结果表明，不同品种桑葚叶总酚含量范围为（20.44 ± 0.15）～（26.35 ± 0.29）mg/g，其中‘条桑五号总酚含量最高，‘滇桑总酚含量最低。

对于不同品种桑葚叶提取物清除DPPH自由基的能力测定发现，‘条桑五号桑葚叶提取物抗氧化活性最强，高于Vc，IC50值为（77.64 ± 0.34）mg/L，‘滇桑桑葚叶提取物抗氧化活性最弱，IC50值为（210.30 ± 0.19）mg/L。‘条桑五号桑葚叶提取物总抗氧化能力（FRAP）TEAC值为（2.58 ± 0.11）mmol/g;‘滇桑桑葚叶提取物总抗氧化能力（FRAP）TEAC值为（0.73 ± 0.04）mmol/g。不同品种桑葚叶总酚含量与抗氧化能力之间存在较大差异。与高欣妍等[28]DPPH清除自由基的抗氧化能力测定结果相近，均高于Vc。与其他研究结果[31-32]相比，本研究中大部分品种桑葚叶提取物抗氧化能力更强。且桑叶中总酚含量与其抗氧化能力之间存在相关性，说明桑葚叶总酚是其抗氧化作用的重要物质基础之一。冯淦熠等[21]总结前人研究结果同样得出相似的结论，桑葚叶的总酚含量可以用作不同品种桑葚叶抗氧化能力的参考标准。但并不是所有品种桑葚叶中总酚含量与抗氧化能力之间存在完全对应的线性关系，一方面可能是因其提取物中含有其他类的抗氧化活性物质;另一方面不同品种桑葚叶间的酚类物质品种和含量存在多样性，彼此之间可能存在一定的协同效应，一定程度上增强了其抗氧化能力。根据品种间所表现出来的不同差异性，不同品种桑葚叶的利用价值也不同，如饲料，药用价值方面等。红果系列，条桑系列以及一些叶果两用的桑葚品种叶子多数较大，或叶片较肥厚，其总酚含量较高，在果实鲜食的同时，叶子具有较高的抗氧化活性，可用作生产天然抗氧化剂来提高桑葚产业经济价值，或用作高品质饲料桑的生产[15]，并可通过超声波提取方法实现工业化生产。作为观赏品种的九曲龙桑，叶片较小且薄，桑叶产量较低，其总酚含量和抗氧化能力也同样处于中下水平，但并不是所有果叶两用，叶片较大、产量较多的桑葚品种均适宜用于天然抗氧化剂生产，可根据不同用途和需求，选择栽培种植相应的桑葚品种。

由于国际蚕丝贸易发展出现滑坡，蚕桑业的发展受阻，我国在农业产业结构方面作出了较大调整[13]。不断调整桑葚的利用结构，增加其生物利用率，根据不同品种桑葚叶中物质含量差异来探索桑葚的新用途，是进一步促进桑葚综合开发和利用的关键。

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责任编辑：沈德发

收稿日期  2020-04-24;修回日期  2020-05-26

基金项目  海南省自然科学基金青年基金项目（No. 320QN320）;广东省优稀水果现代农业产业技术体系创新团队建设项目（No. 2021KJ116）。

作者简介  马飞跃（1987—），女，硕士，助理研究员，研究方向：热带果树功能成分及其生物活性研究与利用。*通信作者（Corresponding author）：杜丽清（DU Liqing），E-mail：mfyflc@yahoo.com。