亚甲基蓝对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的保护作用

程方圆，路 凯，刘 捷,白 宁，徐瑞芬，霍 苗，陈 方*

0 引言

缺血性脑卒中是一种极具破坏性的脑血管疾病，有很高的致残率和死亡率[1]。现阶段，缺血性脑卒中治疗原则是恢复缺血区的血液流通，但某些情况下，恢复血流反而导致更严重的损伤[2]。研究显示，脑缺血再灌注主要损伤血脑屏障的完整性，增加细胞旁路的渗透率，导致氧化应激、炎症反应的发生，最终造成神经元凋亡、脑水肿梗死、神经功能损伤，因此，改善血脑屏障完整性是缺血性脑卒中治疗的关注重点[3-4]。

亚甲基蓝主要应用于高铁血红蛋白血症的治疗，具有抗炎、抗氧化的特点[5]。近年来研究显示，亚甲基蓝对缺血性脑卒中具有保护作用，包括经Nrf2/HO-1信号通路，降低脑中自由基ROS表达水平[6]；抑制线粒体释放细胞色素C,减少细胞凋亡，下调炎症因子表达水平[7]，最终改善神经功能，减少脑梗死体积和脑水肿[8]。然而，迄今为止，亚甲基蓝对血脑屏障的保护作用与机制鲜有报道。因此，本研究观察亚甲基蓝对脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的影响，并探讨其可能的机制。

1 实验方法

1.1 药物与仪器 亚甲基蓝(M9140)：美国SIGMA公司；occuldin、claudin-5蛋白抗体：美国Abcam公司(ab128906)；脂质过氧化物(MDA)、抗氧化酶(SOD)、IL-6、IL-1β试剂盒：南京建成公司；伊文思蓝(Evans Blue,EB)：美国SIGMA公司；颈动脉栓塞线栓：广州佳灵生物有限公司；Western blot仪器：美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪：南京天能公司。

1.2 动物分组与给药 SPF级雄性SD大鼠60只，由西安交通大学实验动物中心提供。SD大鼠按照随机分配的原则分为5组，每组12只：假手术组，模型组，低剂量组(亚甲基蓝1 mg/kg)，中剂量组(亚甲基蓝2 mg/kg)，高剂量组(亚甲基蓝4 mg/kg)。亚甲基蓝组手术前1 d腹腔注射亚甲基蓝，恢复灌注后再次腹腔注射亚甲基蓝溶液，假手术组、模型组手术注射生理盐水。

1.3 大鼠局灶脑缺血模型的建立 采用改良的Longa线栓法[9]建立大鼠缺血再灌注模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)，自颈外动脉残端插入线栓并前进至颈内动脉中阻塞血液流通。缺血2 h后抽出线栓，缝合伤口，使血液流通再灌注24 h。假手术组打开颈动脉后立即缝合。

1.4 神经功能评分法 大鼠造模结束24 h后进行评分，评分标准：0分为无神经缺损症状，可直线行走；1分为左前肢弯曲，无法伸直；2分为不能直行，单向旋转大圈；3分为单侧倾倒，单向旋转小圈；4分为不能行走或瘫痪[10]。

1.5 梗死面积计算 取完整大脑，冷冻0.5 h，将大脑切成2 mm×5 mm切片，2% TTC溶液浸没切片表面，37 ℃条件下避光孵育0.5 h，相机拍摄，Image J量化统计梗死面积，与脑片量化面积对比，记为梗死面积百分比。

1.6 血脑屏障通透性评估 参考文献[11]，动物处死前2 h腹腔注射2%EB溶液，剂量2 ml/kg。动物斩首后，完整取出大脑并精确称重，在2.5 ml PBS溶液中匀浆后，加入2.5 ml三氯乙酸(60%)，3 000 r/min离心30 min，使用分光光度计在610 nm处测定伊文思蓝的吸光度，对比标准曲线计算得出结果。

1.7 试剂盒检测 取梗死侧海马组织，以w∶v=1∶9加入PBS溶液，研磨，静置30 min后12 000 r/min离心30 min，吸取上清液。根据试剂盒说明书添加、孵育、弃去样品与试液，使用酶标仪在试剂盒指定波长下扫描OD值，绘制标准曲线，计算出含量。

1.8 Western blot检测 取梗死侧海马组织，加入组织裂解液，冰块上研磨，静置后离心。取上清液测试BCA试剂盒，加入与上清液等量5×上样缓冲液，沸水浴15 min变性蛋白。根据BCA试剂盒所测蛋白含量进行等量上样。开始SDS凝胶电泳，结束后经PVDF膜转膜，封闭2 h，4 ℃条件下孵育检测蛋白抗体10 h。洗净检测蛋白抗体后室温孵育对应鼠/兔源二抗2 h，洗净二抗后使用显影仪成像，Image J软件对条带进行量化分析。所有蛋白条带灰度值与内参蛋白灰度值比较后进行归一化处理。

1.9 数据处理 采用Graphpad prism 5软件的单因素方差分析中one-way analysis of variance(ANOVA)和Tukey′s test 进行统计分析并作图，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 亚甲基蓝对I/R大鼠脑中梗死面积的影响 大鼠脑缺血再灌注损伤24 h后进行神经功能损伤评分，如图1A所示，与假手术组相比，模型组大鼠神经功能损伤评分显著升高(P<0.05)，高剂量亚甲基蓝显著改善了大鼠神经功能损伤(P<0.05)，而低、中剂量亚甲基蓝并没有显著改善大鼠神经功能评分，提示亚甲基蓝发挥疗效存在剂量依赖性的现象。TTC染色用于显示脑梗死面积，正常脑组织被染成红色而梗死区域脑组织呈白色。如图1B所示，大鼠I/R手术后24 h，缺血侧大脑有显著的梗死，与模型组相比，中、高剂量亚甲基蓝治疗显著减少了大脑梗死面积，而低剂量亚甲基蓝未能改善大鼠脑梗死面积。在神经行为学评分中，低剂量亚甲基蓝治疗效果低于高剂量亚甲基蓝。提示I/R造模成功诱导大鼠出现与临床缺血性脑卒中患者相似的神经功能损伤的症状，大脑部分区域发生水肿梗死，而亚甲基蓝给药能够缓解这一症状且存在剂量依赖性。

图1 亚甲基蓝对脑缺血再灌注的保护作用

2.2 亚甲基蓝对I/R大鼠血脑屏障完整性的影响 MCAO能够损伤血脑屏障结构之间紧密性与完整性，导致血液循环中有害物质进入脑中造成神经损伤。我们通过皮下注射伊文思蓝，检测脑中伊文思蓝含量，确定血脑屏障的完整性。如图2所示，右脑作为未灌注损伤侧大脑，检测出伊文思蓝浓度较低，且各组间没有显著性差异，提示完整的血脑屏障能够减少血液循环中有害物质侵入。在灌注侧大脑中，与假手术组相比，模型组中伊文思蓝浓度显著升高(P<0.05)，提示MACO损伤了大鼠血脑屏障的完整性。而亚甲基蓝对血脑屏障有保护作用，与模型组相比，亚甲基蓝中高剂量(2 mg/kg,4 mg/kg)治疗显著减少了缺血侧大脑中伊文思蓝含量(P<0.05)，且亚甲基蓝低剂量(1 mg/kg)因未达到有效剂量无法保护血脑屏障完整性。

图2 亚甲基蓝对血脑屏障完整性的保护作用。

2.3 亚甲基蓝对I/R大鼠脑中氧化应激水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠脑中SOD活性显著降低，而MDA含量显著升高(P<0.05)，提示脑缺血再灌注手术可诱发氧化应激反应；与模型组比较，亚甲基蓝治疗大鼠脑中 SOD活性显著提升，MDA含量显著降低(P<0.05)，提示亚甲基蓝高剂量(4 mg/kg)可一定程度上抑制脑缺血再灌注引起的大鼠氧化应激反应。见图3。

图3 亚甲基蓝对脑中氧化应激的影响

2.4 亚甲基蓝对大鼠脑中炎症反应的影响 如图4所示，与假手术组相比，I/R造模导致脑中炎性细胞因子IL-6、IL-1β表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，亚甲基蓝高剂量组(4 mg/kg)大鼠脑中炎性细胞因子水平显著降低(P<0.05)。提示I/R导致大鼠脑中产生严重的炎症反应，亚甲基蓝能够降低脑中炎症反应的发生，且存在剂量依赖性，仅亚甲基蓝高剂量(4 mg/kg)能够显著降低脑中炎症反应发生。

图4 亚甲基蓝对脑中炎性相关因子的影响

2.5 亚甲基蓝抑制内皮细胞紧密连结蛋白的降解 与假手术组相比，模型组大鼠脑中occludin与claudin-5表达显著降低(P<0.05)。高剂量亚甲基蓝干预治疗后，与模型组相比，蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图5。

图5 亚甲基蓝对occludin与claudin-5蛋白表达的影响

3 讨论

血脑屏障是维持脑内微环境的稳定、保证大脑正常功能的特殊屏障，是由微血管内皮细胞、星形细胞端足、周细胞和基板组成的一个紧密结构[12]。脑缺血再灌注会导致其紧密结构损伤，直接导致神经元所处生理环境改变，伴随严重的炎症反应与氧化应激，最终会引起突触和神经元功能紊乱。因此，保护血脑屏障的紧密结构是脑缺血治疗的重点[13]。

本研究利用I/R模型造成大鼠行为和认知功能损伤，研究结果显示，模型组大鼠脑中存在严重的梗死现象，伴有行为学和神经功能损伤。亚甲基蓝治疗能够显著减少大鼠脑中梗死面积，改善大鼠的神经功能损伤。在血脑屏障完整性检测中，相比于空白组与未缺血侧大脑，缺血侧脑中伊文思蓝含量显著升高，而亚甲基蓝给药组中，缺血侧脑中伊文思蓝含量显著降低。这些结果表明，亚甲基蓝可能作为一种治疗策略，通过保护血脑屏障完整性来减轻缺血性卒中患者的脑损伤。

脑缺血再灌注过程中，活性氧自由基的过量产生，超过了脑组织和血管内皮紧密连接的内源性抗氧化能力，会导致神经元损伤。研究显示，活性氧自由基能氧化细胞膜和基底膜上的不饱和脂肪酸，引起血管内皮细胞和基底膜损伤，从而破坏血脑屏障完整性[14]。SOD是人体重要的氧自由基清除剂，当氧自由基显著增加时，其含量和活性显著降低，而MDA 是主要脂质过氧化物，能使细胞的结构和功能发生破坏[15]。本研究中，急性缺血再灌注损伤后，亚甲基蓝治疗显著提高了SOD活性，并降低了MDA升高。

神经系统中，炎症介导了多种神经性疾病的发生和发展[16]。已有研究揭示，脑缺血再灌注可诱导NLRP3炎症小体在神经元、小胶质细胞、血管内皮细胞中的活化，激活其下游IL-6、IL-1β等其他炎症因子的表达，增加炎症级联反应，加重神经元的凋亡与脑水肿的程度，进而破坏血脑屏障完整性并导致脑缺血再灌注损伤进一步加重[17]。本研究中，脑缺血再灌注损伤后，大鼠脑中炎性细胞因子急剧增加，而亚甲基蓝治疗后，脑中炎症因子IL-6与IL-1β的表达水平显著降低。

血脑屏障是由内皮细胞紧密连接形成的代谢和物理屏障，血脑屏障的通透性很大程度上取决于内皮细胞之间的膜辅助蛋白，包括occludin及claudin-5蛋白的相互作用。有报道，颈动脉栓塞会引起内皮细胞中occuldin及claudin-5蛋白表达降低[18]。在本研究中，occludin和claudin-5在亚甲基蓝治疗组中显著上调，这意味着亚甲基蓝能够通过上调紧密连接蛋白表达来保护血脑屏障免受缺血和灌注诱导的破坏。

综上所述，亚甲基蓝能够通过缓解脑中氧化应激反应，减轻神经炎症反应，发挥血脑屏障的保护作用，维持完整性，改善脑缺血再灌注损伤后神经功能损伤与大脑局部梗死，其机制可能与上调血脑屏障中紧密连接蛋白occludin与claudin-5表达相关。