基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术分析华佗豆的化学成分

林 婧 ，梁 洁 ，黄团心，黄光强，陈晓思，韦金玉，黄冬芳

（1. 广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200；2. 广西农业职业技术学院 药学系，广西 南宁 530007；3. 广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200；4. 广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁530021；5. 广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，广西 南宁 530200）

华佗豆为旋花科植物丁香茄 Calonyction muricatum（Linn） G. Don.的干燥成熟种子，别名为跌打豆、丁香茄子，始载于《救荒本草》，分布于广西、云南等地[1]。壮瑶民间主要用于治疗跌打损伤、小儿疳积、小儿肺炎等，其疗效显著[2]。本课题组前期研究发现，华佗豆中可能含有生物碱、黄酮、挥发油、酚酸类等化学成分[3]。通过小鼠热板法和二甲苯致小鼠耳廓肿胀等模型对华佗豆的醇提物和水提物进行研究，发现其醇提物不同剂量都发挥出显著的镇痛、抗炎作用[4]。经查阅国内外文献，华佗豆镇痛、抗炎化学成分的研究主要集中在华佗豆的生物碱类成分[5]。而其它类成分是否存在类似的药效物质，有待进一步研究。

UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术分离速度快，灵敏度高，分析时间短，通过高分辨率的质谱精确度，可快速提供精确的相对分子质量，特别适合研究中药多成分的复杂体系，为后期单体化合物的分离奠定基础[6]。本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术对华佗豆的化学成分进行快速地鉴别和分析，根据质谱获得的目标化合物的相对分子质量、碎片离子峰及其色谱保留时间等, 结合相关文献数据，推测华佗豆可能存在的镇痛、抗炎化学成分，为后续华佗豆的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

U3000 型UPLC 液相色谱仪、Q-Exactive 质谱仪及TraceFinder 数据分析系统（美国Thermo Fisher 公司）；Milli-Q synergy 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 材料

华佗豆购自广西金秀县，经广西中医药大学滕建北教授鉴定为旋花科植物丁香茄 Calonyction muricatum （Linn）G.Don.的干燥种子。甲醇、甲酸、乙腈为色谱级；纯水为Milli-Q synergy 系统超纯水 ；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱 为Thermo Gold C18色 谱 柱（2.1 mm ×100 mm，1.9 μm）；流量为0.3 mL/min；进样量为1 μL；柱温为35 ℃。流动相A 为0.1%甲酸-乙腈，流动相B 为0.1%甲酸水（含10 mmol 乙酸铵）溶液；梯度洗脱：0～2.0 min，5% A；2.0～42.0 min，5%～95%A；42.0 ～47.0 min，95% A；47.1 ～50 min，95%～5% A。

2.2 质谱条件

离子源采用H-ESI 源（heated ESI），喷雾电压：3.5 kV （＋）、3.2 kV （-），鞘气体积流量：30 μL/min，离子传输管温度：320 ℃；辅助气体流量：10 μL/min；辅助气温度：300 ℃。扫描方式Full MS/dd-MS2 模式，正、负离子同时采集，正、负离子扫描m/z 范围：100 ～1 500，其中一级Full MS 全扫描选择分辨率为70 000 FWHM，dd-MS2 的二级扫描选择分辨率为17 500 FWHM，特定离子扫描模式为“off”，顶点激发2 ～ 8 s，喷雾气为氮气，碰撞气为高纯氮。

2.3 供试品溶液的制备

华佗豆粉碎后，过3 号筛，称取约50.04 g，分别加入7 倍量的70%与30%的乙醇，超声提取60 min，过滤，浓缩，水浴蒸干成浸膏。称取浸膏0.20 g，加入甲醇超声溶解，并定容至10 mL 的容量瓶，配制成0.20 mg/mL 和0.23 mg/mL 的样品溶液，以12 000 r/min 离心15 min，取上清液，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即可。

2.4 结果

根据上述“2.1”和“2.2”项下色谱条件，华佗豆70%与30%乙醇提取液在正、负离子模式全扫描模式下的总离子流图如图1 所示，结果表明：华佗豆70%与30%乙醇提取液在正、负离子扫描下，获得了良好的离子化效率及分离效果。通过谱库比对和结合参考文献的质谱信息, 快速确证可能存在的化学成分。最终从华佗豆中推断和鉴别出15 个化合物,包括6 个生物碱类、2 个酚酸类、3 个糖类、4 个其它类。目标化合物的相对保留时间、分子式、测定值、理论值及主要碎片离子如表1 所示。

2.4.1 华佗豆生物碱类化合物鉴别 化合物1：该化合物保留时间为0.91 min，在正离子模式下，得到了m/z 136.061 8 [M+H]+质谱信息，m/z 136.061 8[M+H]+发生裂解，分别产生了m/z 119.035 5[M+HNH3]+，109.051 1[M+H-CNH]+，92.024 9[M+H-NH3-CNH]+的碎片离子，结合参考文献[7]，故推测该化合物为腺嘌呤。

化合物2：该化合物保留时间为0.95 min，在正离子模式下，得到了m/z 123.055 5[M+H]+质谱信息，m/z 123.055 5[M+H]+发生裂解，分别失去1 分子的NH3（17） 和CO（28），产生106.029 0 [M+HNH3]+和m/z 96.044 8[M+H-CO]+的碎片离子，得到的m/z 96.044 8[M+H-CO]+的碎片离子继续裂解，失去NH2（16），产生了m/z 80[M+H-CO-NH2]+的碎片离子，m/z 80.050 1[M+H-CO-NH2]+继续裂解，失去H2（2），产生了m/z 78.034 4[M+H-CO-NH2-H2]+的碎片离子，并结合参考文献[8]，推测化合物为烟酰胺。

图1 华佗豆醇提物的总离子流图Fig .1 Total ion chromatograms of ethanol extract of Calonyction muricatum （Linn） G. Don

表1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术对华佗豆中化学成分的鉴定分析Tab. 1 Identification of chemical constituents from the Calonyction muricatum（Linn） G. Don based on UPLC-Q-Exactive technology

化合物3：该化合物保留时间为6.56 min，在正离子模式下 ，得到了m/z 195.087 8[M+H]+质谱信息，m/z 195.087 8[M+H]+发生裂解，分别失去C2H3NO（57）、C3H3NO2（85）、C4H4N2O2（112）和C5H6N2O2（126）的碎片，并产生m/z 138.066 3[M+H-C2H4N2]+、m/z 110.071 6[M+H-C4H10N2]+、m/z 83.060 6[M+H-C5H8N2O]+和m/z 69.045 3[M+HC5H8N3O]+的碎片离子，这与参考文献[9]所报道的典型碎片相似，推测该化合物为咖啡因，推测的裂解过程如图2 所示。

图2 咖啡因可能的裂解过程Fig. 2 Possible cracking process of caffeine

化合物4：该化合物保留时间为6.74 min，在正离子模式下，得到了m/z 226.122 7[M+H]+质谱信息，m/z 226.122 7[M+H]+发生裂解，失去1 分子的CO（28），产生m/z 198.091 6[M+H-CO]+碎片离子，接着该碎片离子又失去1 分子的CH3（15），产生了m/z 183.068 7[M+H-CO-CH3]+的碎片离子，根据参考文献[10-11]，推测该化合物为华佗豆丙碱。

化合物5：该化合物保留时间为8.14 min，在正离子模式下，得到了m/z 230.154 1[M+H]+质谱信息，m/z 230.154 1[M+H]+分别失去1 分子的C3H6（42）、C5H6（44）、C3H8O（60）及C4H6O（70），分别产生了m/z 188.107 1[M+H-C3H6]+，m/z 186.091 4[M+HC5H6]+，m/z 170.096 7[M+H-C3H8O]+及其m/z 160.046 2[M+H-C4H6O]+的碎片离子，根据参考文献[10, 12-13]，推测该化合物为白牵牛碱。

化合物6：该化合物保留时间为13.96 min，在正离子模式下，得到了m/z 336.123 0[M]+质谱信息，m/z 336.1230[M]＋发生裂解，失去1 分子的CH3（15）的碎片，产生m/z 321.099 2 [MCH3]+的碎片离子，随后此碎片离子分别继续裂 解， 一 方 面 失 去1 分 子 的C2H3O（43）， 产生m/z 278.081 4[M-2CH3-CO]＋的 碎 片 离 子；另 一 方 面 失 去1 分 子 的CHO（29）， 产 生m/z 292.096 5[M-CH3-H-CO]+的碎片离子，并结合参考文献[14]，推测该化合物为小檗碱，推测的裂解过程如图3 所示。

图3 小檗碱可能的裂解过程Fig. 3 Possible cracking process of berberine

2.4.2 华佗豆有机酸类化合物鉴别 化合物7：该化合物保留时间为0.93 min ，在正离子模式下 ，得到了m/z 191.019 9[M-H]-质谱信息，m/z 191.019 9[M-H]-发生裂解，一方面失去1 分子的H2O（18），1分子的CO2（44）,产生了m/z 129.019 4[M-H-H2OCO2]-的碎片离子，紧接着该碎片离子分别失去1 分子的CO2（44）和1 分子的H2O（18），产生了m/z 87.825 1[M-H-H2O-2CO2]-的碎片离子和m/z 111.008 8[M-H-2H2O-CO2]-的碎片离子；另一方面准分子离子峰m/z 191[M-H]-，失去2 分子的CO2（44），产生了m/z 102[M-H-2CO2]-的碎片离子，接着该碎片离子分别失去1 分子的CO2（44）和1 分子的CH3（15），最后产生了m/z 57.034 5[M-H-3CO2]-的碎片离子和m/z 87[M-H-2CO2-CH3]-的碎片离子，结合参考文献[15]，推测该化合物为柠檬酸。

化合物8：该化合物保留时间为11.06 min ，在正离子模式下 ，得到了m/z 515.119 8[M-H]-质谱信息，m/z 515.119 8[M-H]-发生裂解，失去1 分子的碎片离子C9H6O3（162）和C16H16O8（336），分别产生了m/z 353.088 5[M-H-C9H6O3]-和m/z 179[M-H-C16H16O8]-碎片离子，接着这两个碎片离子分别失去1 分子C9H6O3（162），CO2（44），分别产生了m/z191.056 3[M-H-2C9H6O3]-和m/z 135.045 4[M-H-C16H16O8-CO2]-的碎片离子，根据参考文献[16]，推测该化合物为异绿原酸A，推测的裂解过程如图4 所示。

2.4.3 华佗豆其它类化合物鉴别 化合物9：该化合物保留时间为10.82 min ，在正负离子模式下，分别产生了m/z 534.212 6[M+H]+和m/z 532.197 9[MH]-质谱信号，其准分子离子峰m/z 534.212 6[M+H]+发生裂解，失去1 分子的C17H24O5（308），产生了m/z 226.122 7[M+H-C17H24O5]+的碎片离子，结合参考文献[17]，推测该化合物为6, 7-dehydro-11-hydroxy-12, 13-epoxyterpendole A。推测的裂解过程如图5 所示。

图4 异绿原酸A 可能的裂解过程Fig. 4 Possible cleavage process isochlorogenic acid A

图5 6,7-dehydro-11-hydroxy-12,13-epoxyterpendole A可能的裂解过程Fig. 5 Possible cleavage process of 6,7-dehydro-11-hydroxy-12,13-epoxyterpendole A

化合物10：该化合物保留时间为20.84 min，在正离子模式下，得到了m/z 293.176 1[M]＋质谱信息，m/z 293.176 1[M]＋发生裂解，先失去1 分子的C4H9（57），接着再失去1 分子的CH3（15），分别产生了m/z 236.105 7[M-C4H9]＋和m/z 221.154 7[M-C4H9-CH3]＋的碎片离子，结合参考文献[18]，该化合物在旋花科植物中有发现，故推测该化合物为亚油酸甲酯，推测的裂解过程如图6 所示。

化合物11：该化合物保留时间为42.12 min，在正离子模式下 ，得到了m/z 409.382 8[M]＋质谱信息。在二级质谱碎片图中出现了典型的碎片离子m/z 409.382 6、367.334 5、353.324 0、231.210 9、175.148 4、149.132 5、121.101 4、109.101 5、95.086 0、81.070 4，结合参考文献[19]，故推测该化合物为角鲨烯。化合物12：该化合物保留时间为42.21 min，在正离子模式下，得到了m/z 427.393 3 [M]＋质谱信息。在二级质谱碎片图中出现了典型的碎片离子m/z 409.382 9、371.327 3、285.287 4、217.241 6、109.101 5、95.086 0、81.070 5，经与参考文献[20] 对照，推测该化合物为羽扇豆醇，推测的裂解过程如图7 所示。

2.4.5 华佗豆糖苷类化合物鉴别 化合物13：该化合物保留时间为0.83 min，在负离子模式下 ，得到了m/z 181.071 8[M-H]-质谱信息，m/z 181.071 8[M-H]-发生裂解，失去1 分子的H2O（18），产生m/z 163.067 0[M-H-H2O]-的碎片离子， 得到的碎片离子继续裂解，一方面失去1 分子的C2H6O2（62）和2 分子的CH2（14），产生m/z 73.029 5[M-H-H2OC2H6O2-2CH2]-的碎片离子；另一方面m/z 163.067 0[M-H-H2O]-失去1 分子的C4H8O3（104），得到了m/z 59.013 8[M-H-H2O-C4H8O3]-的碎片离子，结合参考文献[21-22]，推测该化合物为甘露醇。

图6 亚油酸甲酯可能的裂解过程Fig. 6 Possible cracking process of methyl linoleate

图7 羽扇豆醇可能的裂解过程Fig. 7 Possible cracking process of coumarin alcohols

化合物14：该化合物保留时间为0.84 min，在正离子模式下，得到了m/z 549.167 4[M+HCO2]-质谱信息。在二级质谱碎片图中出现了典型的碎片离子，m/z 503.045 6、221.066 7、113.024 4、101.034 5、89.024 4、71.013 8、59.013 8 的碎片离子，结合参考文献[23]，推测该化合物为棉籽糖。

化合物15：该化合物保留时间为0.86 min，在正离子模式下 ，得到了387.114 6[M-H]-质谱信息，387.114 6[M-H]-发生裂解，相继失去1 分子的C4H33O5（161），1 分 子 的C2H4O2（60） 及1 分子的C2H2O（42），分别产生了m/z161.024 4[M-HC4H33O5]-，m/z 101.024 3[M-H-C4H33O5-C2H4O2]-，m/z 59.013 8 [M-H-C4H33O5-C2H4O2-C2H2O]-的碎片离子，结合参考文献[21]，推测该化合物为乳果糖。

3 讨论

根据上述鉴别的化合物并结合参考文献，通过对比不同生物碱类镇痛活性发现，华佗豆碱丙具有镇痛活性高、药效持续时间长的特点[5]。在临床应用中, 低剂量的咖啡因常被用于辅助镇痛药，与其它镇痛药物合用而发挥协同镇痛效应[24]。研究发现，甘露醇镇痛效果良好，可缓解患者鼻术后不适[25]。在抗炎方面，小檗碱可以通过抑制各种炎症介质的产生与表达，以及抑制炎症通路的激活抑制炎症反应[26]。亚油酸甲酯能降低白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子和一氧化氮水平等炎症相关因子，对急、慢性炎症均有显著的改善作用[27]。烟酰胺可通过抑制一系列的促炎因子，如肿瘤坏死因子 α、白细胞介素-6、白细胞介素-8 发挥出一定的抗炎作用[28]。羽扇豆醇能减少促炎性细胞因子、降低脑缺血再灌注损伤的炎性反应[29]。同时，异绿原酸（二咖啡酰奎宁酸）类物质具有抗炎及抗肝炎及 AIDS 病毒等作用，角鲨烯也显现出一定的抗炎活性[30-31]。上述鉴定出的这些成分可能与华佗豆呈现的镇痛抗炎作用密切相关。

4 结论

本实验采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术对华佗豆中化学成分进行了分析研究，结合参考文献及其图谱比对，分析鉴定出华佗豆的15 个化合物，其中包括6 个生物碱类、2 个酚酸类、3 个糖类、4 个其它类，其中小檗碱、烟酰胺、咖啡因、柠檬酸、甘露醇、棉籽糖、乳果糖、羽扇豆醇、6, 7-dehydro-11-hydroxy-12, 13-epoxyterpendole A 为首次从该植物中推测鉴定出来。本研究为更好地明确华佗豆的化学成分提供了快速检测的方法，同时也为进一步揭示和阐明华佗豆药效物质基础及质量控制奠定了研究基础。