高效液相色谱多波长同时测定阿咖酚散中对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林、水杨酸

胡海侠，高燕，宏伟

（淮南市食品药品检验中心，安徽淮南 232007）

阿咖酚散是由对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林组成的化学复方制剂，主要用于治疗普通感冒或流行性感冒引起的发热，也用于缓解轻至中度疼痛如头痛、关节痛、偏头痛、牙痛、肌肉痛、神经痛、痛经。目前国家药品标准［1］中该药含量测定采用单一波长高效液相色谱法，色谱峰面积差异较大，且所用对照品咖啡因为国家管控制剂，不易取得，标准中杂质测定灵敏度不高，且阿司匹林易分解为水杨酸杂质，导致假阳性。

笔者参考高效液相色谱波长切换法［2–4］及一测多评法在石韦及其制剂［5］、长城感冒片［6］、六神丸［7］及桑菊感冒颗粒［8］等含量测定中的应用，采用高效液相色谱波长切换法同时测定阿咖酚散中3 种成分及杂质水杨酸的含量，确定了咖啡因对对乙酰氨基酚的相对校正因子，可不依赖对照品对咖啡因进行定量，并提高了分析灵敏度。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC–20AT 型，日本岛津公司。

紫外分光光度紫计：UV–2700型，日本岛津公司。

超声波清洗器：KQ–500E 型，昆山市超声仪器有限公司。

电子天平：XS205DU 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多集团。

甲醇、磷酸二氢钾：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

甲醇：色谱纯，美国默克密理博公司。

磷酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。对乙酰氨基酚对照品：质量分数为99.9%，批号为100018–201610，中国食品药品检定研究院。

咖啡因对照品：质量分数为100.0%，批号为171215–201010，中国生物制品检定所。

阿司匹林对照品：质量分数为99.8%，批号为100113–201706，中国食品药品检定研究院。

水杨酸对照品：质量分数为99.7%，批号为100106–201605，中国食品药品检定研究院。

阿咖酚散样品：批号为1911001、2004001，盖天力医药控股集团华东药业有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Venusil MP–C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司；流动相：磷酸盐缓冲液（0.01 mol／L 磷酸二氢钾溶液，用磷酸调解pH 至2.6±0.1）–甲醇（体积比为7∶3），流量为1.0 mL／min；检测波长：对乙酰氨基酚、咖啡因276 nm(0～10 min)，阿司匹林254 nm(10～18 min)，水杨酸241 nm(18～25 min)；柱温：30℃；进样体积：20 μL；理论塔板数：大于1 000；分离度：大于2.0。

1.3 溶液配制

对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林混合对照品储备液：精密称取对乙酰氨基酚对照品50 mg、咖啡因对照品12 mg 和阿司匹林对照品92 mg 于100 mL 容量瓶中，加入流动相约80 mL，超声溶解，用流动相稀释至标线，混匀。制成含对乙酰氨基酚0.50 mg／mL、咖啡因0.12 mg／mL、阿司匹林0.92 mg／mL 的混合对照品储备液。

对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林系列混合标准工作溶液：分别移取混合对照品储备液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL 至8 只10 mL容量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，得到对乙酰氨基酚质量浓度分别为25、50、75、100、125、150、175、200 μg／mL，咖啡因质量浓度分别为6、12、18、24、30、36、42、48 μg／mL，阿司匹林质量浓度分别为46、92、138、184、230、276、322、368 μg／mL的系列混合标准工作溶液。

水杨酸储备液：0.18 mg／mL，取水杨酸对照品18 mg，精密称定，加入流动相约80 mL，超声溶解，用流动相稀释至标线，摇匀。

水杨酸系列标准工作溶液：分别移取水杨酸储备 液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL 至5 只100 mL容量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，得到水杨酸质量浓度分别为0.45、0.90、1.80、3.60、7.20 μg／mL的水杨酸系列标准工作溶液。

阴性样品溶液：制备不含对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林的样品，按1.4 方法进行样品处理。

1.4 样品处理

取阿咖酚散国家质量标准中“装量差异”项下的内容物，混合均匀，精密称取适量(约相当于对乙酰氨基酚50 mg)，置于100 mL 容量瓶中，加入流动相约80 mL，超声溶解，用流动相稀释至标线，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置于25 mL 容量瓶中，用流动相稀释至标线，摇匀。

2 结果与讨论

2.1 测定波长选择

国家药品标准方法中使用同一波长测定对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和杂质水杨酸的含量，同一色谱图中色谱峰面积差异较大。查阅文献得知对乙酰氨基酚、咖啡因的测定波长有215、225、227、257 和275 nm 等［3，9–11］，阿司匹林和水杨酸的测定波长有215、302、276 和300 nm 等［9，12–13］。紫外分光光度计的光谱扫描结果表明，对乙酰氨基酚和咖啡因在276 nm 处均有最大吸收，色谱图中与其它组分差异较大，故对乙酰氨基酚和咖啡因的测定波长选择276 nm；阿司匹林在276 nm 处也有最大吸收，考虑到本品中阿司匹林含量较高，选择吸收系数相对较低的254 nm 为阿司匹林的测定波长；水杨酸在241 nm 处的吸收值约为在303 nm 处的两倍，考虑到该项目为限量检查，故水杨酸的测定波长选择241 nm。

2.2 色谱柱选择

文献［3–4，9–12，14–18］表明，在用高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林及相关物质水杨酸时，采用的色谱柱均为C18柱，柱长150 mm 或250 mm，内径多为4.6 mm，涂层厚度为5 μm。分别采用Venusil MP–C18型色谱柱和CAPCELL PAK C18型色谱柱，按1.2 仪器工作条件检测，各成分均分离理想，色谱峰形良好，因此最终选择Venusil MP–C18型色谱柱。

2.3 柱温和流动相比例选择

使用非极性固定相色谱柱分离分析，当流动相中有机相的比例增加时，各组分的保留时间均提前，且咖啡因相对于对乙酰氨基酚保留时间缩短较多；柱温分别为20 ℃和25 ℃时，相对保留时间变化不大，在30 ℃时相对保留时间均前移，如表1。根据表1 试验结果，选择水相和有机相的体积比为7∶3，柱温为30 ℃。

表1 不同柱温和流动相下的保留时间 min

2.4 色谱图

水杨酸在241 nm 波长处吸光度远大于在245 nm 处的吸光度，水杨酸分别在241、245 nm 测定波长下的高效液相色谱图如图1 所示。由图1 可知，采用241 nm 为检测波长，检测灵敏度有较大提高。

国家标准方法测定阿咖酚散含量的高效液相色谱图如图2（a）所示，图2（b）为多波长测定法的色谱图。由图2 可知，多波长测定法在可变波长下各组分色谱峰均有理想的峰形，定量更为准确。

图1 水杨酸在不同检测波长下的高效液相色谱图

图2 阿咖酚散含量测定的高效液相色谱图

2.5 咖啡因定量

国家标准方法测定阿咖酚散含量时，所使用的咖啡因对照品为国家管控药品，不易取得。而在本实验条件下，咖啡因与对乙酰氨基酚的保留时间接近，可以考虑以乙酰氨基酚作为内标物，计算出咖啡因的相对校正因子，先用标准曲线法对对乙酰氨基酚定量，然后利用内标法对咖啡因间接定量。

分别测定1.3 配制的8 个浓度系列混合标准工作溶液，平行测定6 次，测定结果列于表2。由表2 可知，咖啡因与对乙酰氨基酚的相对校正因子为0.363 3。

表2 咖啡因与对乙酰氨基酚之间的相对校正因子（n=6）

2.6 线性方程与检出限

按1.2 色谱条件测定1.3 配制的对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林系列混合标准工作溶液，取上述溶液各20 μL 注入高效液相色谱仪，分析完毕后，以色谱峰面积（Y）对各组分进样质量（X）进行线性回归，分别得各组分的线性方程、相关系数。对乙酰氨基酚线性方程为Y=4.6×105X+9 468.1，相关系数为1.000 0，线性范围为0.491 5～3.932 1 μg；咖啡因线性方程为Y=3.2×106X–845.93，相关系数为0.999 9，线性范围为0.126 5～1.012 0 μg；阿司匹林线性方程为Y=3.0×105X+14 947，相关系数为0.999 9，线性范围为0.922 7～7.381 2 μg。另取水杨酸标准工作溶液，同法操作得水杨酸的线性方程为Y=2.4×106X–5 463.1，相关系数为0.997 5，线性范围为0.000 882 3～0.141 2 μg。参照中国药典分析方法验证指导原则的直观法试验并计算［19］，得到水杨酸的检出限为0.441 2 ng，定量限为0.882 3 ng。

2.7 稳定性试验

精密吸取供试溶液20 μL，于配制后0、2、4、8、12 h 分别进样测定，测定结果列于表3。

表3 稳定性试验结果 %

由表3 数据可知，对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水杨酸含量测定值的相对标准偏差分别为0.83%、0.89%、0.97%、80.79%（n=5），表明对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林在室温12 h 内稳定。因阿司匹林降解产物为水杨酸，故水杨酸含量测定值随时间增长而增大，而阿司匹林峰面积随时间的增长而减小。

阿司匹林在碱性环境易水解，而酸性环境能抑制其水解，故实验中应注意调节流动相的pH 值在2.6 以下，以降低阿司匹林的水解速率。以时间为横坐标，水杨酸色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果显示，随着时间的延长阿司匹林的降解速率加快。建议杂质水杨酸应在配制后2 h 内进样，对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林含量在配制后12 h 内进行测定，样品溶液临用现配。

2.8 精密度试验

按本实验方法测定同一批阿咖酚散样品中对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林、水杨酸含量，平行测定5 次，结果列于表4。

表4 精密度试验结果 %

试验结果表明，对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水杨酸测定结果的相对标准偏差分别为1.16%、1.35%、1.23%、20.05%，说明本方法测定乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林所得数据精密度良好，虽然水杨酸含量较小，相对标准偏差相对较大，但亦可满足测定需要。

2.9 加标回收试验

按照处方比例，精密称取相当于处方量80%、100%和120%的对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林对照品，分别加入相应量的混合辅料及其它组分，同法平行制备两份样品，其中一份加入限定量的水杨酸，按1.4 步骤操作，以本法测定，计算各组分及水杨酸的回收率，结果列于表5。

表5 样品测定结果 %

由表5 可知，对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林、的平均回收率分别为99.9%、101.2%、98.4%，水杨酸的加标回收率为99.0%，表明本方法测量准确度较高。

2.10 比对试验

分别取1.4 制备的样品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，采用多波长法同时测定阿咖酚散中对乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水杨酸的含量，并将测定结果与标准方法进行比对，比对结果见表6。由表6 可知，与标准方法相比，乙酰氨基酚、咖啡因、阿司匹林和水杨酸本法测定值的相对误差分别为0.32%、0.41%、0.75%和9.09%。

表6 比对试验结果 %

3 结语

用多波长法测定阿咖酚散中3 种成分及杂质准确、灵敏，一测多评法在相似色谱及仪器条件下，可以用于阿咖酚散的定量检测和质量控制。