多油辣木PKM-1卡那霉素耐受性研究

张 慧，黄苏南，杜建武，王 韦，杨钺戈，罗 琼，曾千春*

(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 云南辣木研究所，云南 昆明 650201；3.云南农业大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201)

【研究意义】多油辣木(Moringaoleifera)为辣木科Moringaceae，辣木属Moringa，多年生乔木。原产于印度北部喜马拉雅山南麓，是一种热带、亚热带多功能植物[1-2]。多油辣木营养丰富，在印度有近千年食用史[3]。近年从多油辣木中选育出来的新品种PKM-1，由于干热生态区种植时虫害较为严重，其推广及生产应用受到限制。【前人研究进展】随着基因工程技术的发展，转基因技术已广泛应用于提高作物抗虫性[4]。在植物转基因的初步检测中，筛选剂主要分为2大类：抗生素类和氨基酸类，在抗生素类中，卡那霉素是目前植物遗传转化中应用最广泛筛选剂之一[5]。为了提高筛选效率，遗传转化中，确定合适的抗生素筛选浓度是其重要环节。卡那霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，通过干扰植物细胞中叶绿体及线粒体的蛋白质合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物细胞的死亡[6]。因此，卡那霉素以其选择效率高、副作用小及成本较低等优点被广泛应用于双子叶植物遗传转化中。【本研究切入点】目前，已报道利用卡那霉素进行筛选的植物超过50个属，其中包含棉花[7]、桑树[8]、番木瓜[9]、橡胶[10]等双子叶植物，以及玉米[11-12]等极少数单子叶植物。虽然有学者开始对多油辣木PKM-1组织培养进行探索[13-14]，但辣木遗传转化相关研究迄今未见报道。【拟解决的关键问题】分析多油辣木无菌苗上胚轴、嫩叶以及由上胚轴诱导的愈伤组织在增殖阶段及其愈伤组织分化阶段，对5种卡那霉素浓度的耐受性，确定nptII为筛选标记遗传转化多油辣木PKM-1时，愈伤组织阶段和分化植株阶段合适的卡那霉素筛选浓度，为辣木遗传转化时卡那霉素筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

多油辣木PKM-1种籽由云南省元江县依江风辣木产业开发有限公司提供。主要器材：超净工作台(SW-CJ-2D，上海希而科有限公司制造)，高压灭菌锅(MLS-3780，日本三洋公司制造)，光照培养箱(LRH-70，上海一恒科学仪器有限公司制造)，电子分析天平等(LRH-70，上海一恒科学仪器有限公司制造)。主要试剂：卡那霉素、1/2 MS培养基、蔗糖、琼脂、6-BA、NAA。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 萌发培养基为1/2 MS，不添加激素；愈伤组织诱导培养基为1/2 MS，添加6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1；分化培养基为MS，添加6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。所有培养基附加蔗糖3 %，琼脂0.6 %，pH值调节至5.5～6.0，0.1～0.15 kP，121 ℃灭菌20 min。所有激素在超净工作台内过滤灭菌，再添加于灭菌后的培养基中，充分摇匀分装于组培瓶中。

1.2.2 辣木无菌苗的获得 选取籽粒饱满的辣木籽，于超净台中剥去种壳，用75 %酒精消毒10 s，倒去酒精，再用20 %次氯酸钠震荡消毒5 min，无菌水冲洗3～5次，种仁置于无菌滤纸上吸去水分，接种于萌发培养基中，每瓶4粒。(25±2)℃，光照12 h/d，弱光照培养10 d左右即可得到株高3～5 cm的无菌苗。

1.2.3 卡那霉素耐受性试验 设上胚轴和嫩叶诱导愈伤组织时卡那霉素浓度梯度：0、30、50、70、90、110 mg·L-1，愈伤组织分化植株时卡那霉素浓度梯度：0、10、20、30、40、50 mg·L-1，在超净工作台中，灭菌后的培养基冷却至60 ℃左右时加入卡那霉素，充分摇匀，分装于培养皿中。取生长良好的PKM-1无菌苗上胚轴与嫩叶，分别接种于前述卡那霉素浓度梯度的愈伤组织诱导培养基中，(25±2)℃，遮光培养，每20 d继代1次，30 d后统计出愈率和死亡率。取上胚轴诱导的愈伤组织，分别接种于不同浓度卡那霉素的分化培养基中，(25±2)℃，每天光照12 h，弱光照培养30 d后统计死亡率。试验重复3次。外植体膨大至接种时2倍视为产生愈伤组织，未膨大和褐化定为死亡。“-”愈伤组织直径小于等于0.5 cm；“+”愈伤组织直径为0.5～1.0 cm；“++”愈伤组织直径为1.0～1.5 cm；“+++”愈伤组织直径大于等于1.5 cm，同时按下式统计出愈率、死亡率。

出愈率(%)=出愈外植体数/接种外植体总数×100

死亡率(%)=外植体死亡数/接种外植体总数×100

1.3 数据处理

采用SPSS软件对数据进行统计和显著性检验等分析。

2 结果与分析

2.1 卡那霉素对PKM-1上胚轴诱导愈伤组织的影响

由图1和表1可知，与对照相比，添加卡那霉素的培养基对上胚轴诱导愈伤组织均具有一定的抑制作用。上胚轴诱导的愈伤组织诱导率均低于对照，且随着卡那霉素浓度的提高，出愈率逐渐降低，死亡率迅速上升。对照培养10 d左右即可诱导出淡绿、较紧实的愈伤组织(图2-A)。卡那霉素30 mg·L-1时，出愈率80.00 %，极显著低于对照94.82 %；卡那霉素50 mg·L-1时，上胚轴细胞团膨大变缓，出愈率下降为49.63 %，与其他处理呈极显著差异；卡那霉素70 mg·L-1时，细胞团膨大明显受到抑制，外植体呈黄褐色，出愈率为20.74 %，与其他组别间呈极显著差异；卡那霉素90和110 mg·L-1时，上胚轴不膨大，未诱导出愈伤组织，且逐渐死亡。可见，PKM-1上胚轴诱导愈伤组织阶段的卡那霉素耐受浓度为50～70 mg·L-1。

表1 不同卡那霉素浓度对PKM-1愈伤组织诱导和分化植株的影响

2.2 卡那霉素对PKM-1嫩叶诱导愈伤组织的影响

与对照相比，添加卡那霉素的培养基对嫩叶诱导愈伤组织均具有一定的抑制作用(图3)。由表1可知，嫩叶愈伤组织诱导率均低于对照，且随着卡那霉素浓度的提高，出愈率逐渐降低，死亡率迅速上升。对照培养30 d左右，嫩叶卷曲膨大，叶表面或叶缘处形成淡绿色愈伤组织，且愈伤组织紧实，有小颗粒状突起(图2-B)，出愈率为93.33 %。卡那霉素30 mg·L-1时，嫩叶膨大变缓，出愈率为70.37 %，极显著低于对照；50 mg·L-1卡那霉素时，嫩叶膨大受到严重抑制，出愈率28.89 %，与其他处理呈极显著差异；卡那霉素70 mg·L-1时，嫩叶无卷曲膨大，且逐渐褪绿变白，出愈率为6.67 %，极显著低于对照、30 mg·L-1处理和50 mg·L-1处理；卡那霉素90和110 mg·L-1时，嫩叶褪绿变白的比例也逐步提高，无愈伤组织形成。因此，PKM-1嫩叶诱导愈伤组织阶段的卡那霉素耐受浓度为30～50 mg·L-1。

2.3 卡那霉素对PKM-1愈伤组织分化植株的影响

与对照相比，添加卡那霉素的培养基对愈伤组织分化植株均具有一定的抑制作用(图4)。由表1可知，愈伤组织分化植株增殖均低于对照，且随着卡那霉素浓度的提高，愈伤组织增殖变差，死亡率上升。培养30 d，对照愈伤组织紧实，颜色深绿，表面有小颗粒状突起，且增殖良好(图2-C)，死亡率为19.26 %；卡那霉素10 mg·L-1时，愈伤组织增殖开始受到抑制，死亡率为30.56 %，极显著高于对照；20 mg·L-1卡那霉素时，愈伤组织增殖受到较严重影响，死亡率上升为40.74 %；卡那霉素30 mg·L-1时，愈伤组织基本不增殖，死亡率上升为95.56 %，与对照、10和20 mg·L-1组别呈极显著差异；卡那霉素40和50 mg·L-1时，愈伤组织完全死亡。因此，PKM-1愈伤组织分化植株时卡那霉素耐受性是20～30 mg·L-1。

3 讨 论

植物基因工程中，愈伤组织诱导和分化植株阶段的卡那霉素耐受性存在较大差异[15-17]。楸树组培苗生根培养时卡那霉素耐受浓度为100～150 mg·L-1，浓度低于100 mg·L-1时部分茎段干枯，少部分为绿，浓度为150 mg·L-1以上时，极少上部为绿，且基部干枯[15]；无菌苗嫩叶卡那霉素筛选浓度为40 mg·L-1，低于30 mg·L-1时，嫩叶会产生愈伤组织，提高浓度至40 mg·L-1时，嫩叶大量褐化，无愈伤组织形成[16]；在山葡萄叶柄愈伤组织分化时，20 mg·L-1的卡那霉素浓度已开始抑制愈伤组织分化植株，提高浓度至30 mg·L-1时，未分化的愈伤组织几乎不能生长，故将筛选浓度定为20 mg·L-1[17]。通过试验，辣木PKM-1上胚轴诱导愈伤组织的卡那霉素耐受浓度为50～70 mg·L-1，过低则筛选效果不明显，过高则会完全抑制愈伤组织的诱导；嫩叶诱导愈伤组织的卡那霉素耐受浓度为30～50 mg·L-1，嫩叶膨大受抑制，但仍可诱导出部分愈伤组织；愈伤组织分化植株的卡那霉素耐受浓度为20～30 mg·L-1，此时愈伤组织增殖变缓，但不会完全被抑制。

试验过程中注意到，添加卡那霉素的培养基中，随着浓度的增加，上胚轴细胞团膨大逐渐变缓，出愈率降低，部分上胚轴失水，逐渐褐化直至死亡，欧阳乐军等[18]在抗生素对尾巨桉诱导愈伤组织试验中也发现外植体失水褐化情况。嫩叶诱导愈伤组织过程中，随着卡那霉素浓度提高，嫩叶膨大受抑制，出愈率下降，褪绿变白的比例也逐渐升高。耿天龙[19]等也观察到金发草的愈伤组织对卡那霉素敏感性很强，当卡那霉素浓度为10 mg·L-1时，金发草愈伤组织的生长和分化受到明显抑制，并出现大量白化苗。

4 结 论

多油辣木PKM-1愈伤组织分化阶段较之愈伤组织增殖阶段对卡那霉素更敏感。多油辣木PKM-1上胚轴的卡那霉素筛选浓度宜为70 mg·L-1，叶片诱导愈伤阶段为50 mg·L-1，愈伤组织分化阶段为30 mg·L-1。这些结果为应用nptII作为筛选标记基因，开展多油辣木抗虫转基因研究，采用卡那霉素筛选提供了基础和参考。