乙肝相关性肝癌组织中mTOR、HBx蛋白的表达及意义

金宏凯，刘星，高峰，蔺广荣

(1.锦州医科大学；2.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000；3.滨州市人民医院普外科，山东 滨州 256610)

随着人类生活水平的提高及生活方式的改变，肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发病率呈每年递增的趋势，成为最致命的癌症之一[1]。90%以上为肝细胞癌，其主要病因与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)有关[2]。据统计，HBV携带者发生HCC的相对危险性是非携带者的10倍。由于其恶性程度高，起病隐匿，发觉时已处于中晚期，失去最佳手术时机[3]。因此探讨其发病机制具有重大意义。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种高度进化的保守的苏氨酸/丝氨酸激酶，在细胞内外生长信号和细胞代谢整合中发挥重要的作用[3]581-585。HBx基因是HBV基因组中最小的开放性读码框，包含四段重叠的开放阅读框，分别编码病毒折叠、核心蛋白、病毒聚合酶和调节性x蛋白(HBx)，其中HBx蛋白在调节肝癌细胞增殖、发展及凋亡发挥重要作用。目前国内外文献较少报道mTOR、HBx蛋白在乙肝相关性肝癌联合表达研究。本研究通过免疫组织化学方法检测在乙肝相关性肝癌中的mTOR和HBx两项指标的表达情况，并探讨临床病理参数及预后与其表达的相互关系，提供一种关于乙肝相关性肝癌治疗靶点的新思路，也希望为临床上乙肝相关性肝癌的预后随访提供有意义的参考数据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2010年1月至2015年5月于锦州医科大学附属第一医院行手术切除并由两位高年资病理学家双盲法观察、确诊无误的肝癌组织及对应的癌旁组织(距离癌灶>3 cm)标本共69例。所有患者临床及随访资料完整，术前均未行放化疗及其它抗肿瘤治疗。所有患者均具有明确的HBV 病毒感染病史或 HBV-DNA 检测阳性。69例肝癌患者中，男性40例，女性29例；年龄41～76岁，平均(54.8±12.3)岁；肿瘤直径≤5 cm 30例，>5 cm 39例；肿瘤数目单发26例，多发43例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期42例；有淋巴结转移22例，无淋巴结转移47例；低分化38例，高中分化31例；甲胎蛋白(AFP)水平≤200 ng/mL 35例，>200 ng/mL 34例；获得术后3～50个月随访者61例，失访8例。参照2010年美国癌症联合会(AJCC)分期方法进行临床分期。本研究通过锦州医科大学附属第一医院医学伦理会审批，所有患者均已签署知情同意书。

1.2 主要实验试剂

一抗mTOR购自沈阳万类生物科技有限公司；一抗HBx购自北京中杉金桥生物技术开发公司；即用型SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫组化染色

免疫组织化学技术采用SABC法，一抗均按1∶200稀释，具体操作按照试剂盒说明书进行。组织标本经4%甲醛固定，进行常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋等实验步骤处理，以4 μm厚度进行连续切片，微波修复，3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，之后进行血清封闭。依次加入一抗、二抗及Strept Avidin-Biotin Complex，随后DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明，最后采用中性树胶封片。阴性对照为取代一抗的PBS。

结果判定：以细胞膜或细胞质内出现棕黄色、黄色或棕褐色颗粒为阳性表达。本次实验染色结果由两位经验病理科医生双盲法独立阅片。使用了半定量计分法，对阳性细胞进行计数：随机选取5个200×的高倍镜视野，根据每张切片的阳性细胞的百分率进行计数，小于5%记为0分，5%～25%(包括5%)记为1分，25%～50%(包括25%)记为2分，大于50%(包括50%)记为3分。着色强度分类按照：褐或棕褐色记为3分，黄或棕黄色记为2分，淡黄色记为1分，无着色记为0分。两者记分相乘大于等于4分记为免疫组化阳性(+)，小于4分记为免疫组化阴性(-)。

1.4 随访

术后对患者每3个月进行1次定期随访，主要以门诊复查或电话随访形式进行。随访截止时间为2018年9月30日。随访的主要内容包括患者一般临床资料及生存状态。

1.5 统计学分析

运用 SPSS 22.0软件对统计数据进行分析，计数资料以百分比(%)作为表示，比较用χ2检验，相关性分析运用Spearman进行分析，选择Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较用Log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 mTOR、HBx在癌组织及癌旁组织中的表达

mTOR、HBx主要定位于细胞膜或细胞质内，镜下看到黄色或者棕褐色颗粒，癌旁组织不表达或局灶呈弱表达，见图1、图2。mTOR、HBx在癌组织(57.97%，66.67%)的表达均高于癌旁组织(11.59%，17.39%)，经χ2检验，差异有统计学意义(χ2分别为32.711、34.381，均P<0.001)。

图1 mTOR、HBx在癌组织中的表达(SABC,200×)

图2 mTOR、HBx在癌旁组织中的表达(SABC,200×)

2.2 mTOR、HBx蛋白表达与乙肝相关性肝癌临床病理特征的关系

癌组织中mTOR、HBx蛋白的表达均与TNM分期、分化程度和淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者年龄、性别、肿瘤大小、数目及AFP水平无关(P>0.05)，见表1。

表1 mTOR、HBx蛋白表达与乙肝相关性肝癌临床病理特征的关系

2.3 乙肝相关性肝癌组织中mTOR、HBx蛋白表达相关性

Spearman分析显示癌组织中mTOR、HBx蛋白表达呈正相关(r=0.644，P=0.000)，见表2。

表2 乙肝相关性肝癌组织中mTOR、HBx蛋白表达相关性

2.4 mTOR、HBx蛋白的表达与乙肝相关性肝癌患者预后之间的关系

在已获得随访资料的61例患者中，mTOR和HBx共高表达37例，低表达20例。通过用Kaplan-Meier绘制生存分析曲线，发现高表达组中位生存时间为13个月，95%置信区间为10.754～15.246；低表达组为27个月，95%置信区间为22.671～31.329，经Log-rank检验分析比较两者具有统计学差异(P=0.031)，见图3。

图3 mTOR、HBx在癌组织中总生存率分析

3 讨 论

自噬是溶酶体介导的细胞内代谢分解的过程，其调节受多因素影响[4]。目前已发现40多种自噬相关蛋白参与肿瘤细胞的自噬通路。其中mTOR发挥重要的调节功能。mTOR基因定位1p36.2，由2549个氨基酸编码而成蛋白，分子量为280 KDa，是PI3K/Akt/mTOR信号通路的关键信号转导分子。在生物体内以mTORC1和mTORC2两种形式存在，通过逐级磷酸化下游蛋白来加速细胞周期、抑制细胞凋亡及提高肿瘤的活性[5]。mTORC1上游调控因子主要为胰岛素、氧气、生长因子、营养状况及GMP/GTP等[6]。本质是整合信号通路的中央细胞激酶，调节合成和分解代谢过程。mTORC2能磷酸化血清/糖皮质激素激酶(SGK)家族成员，而SGK3的激活与肿瘤有关，能够通过INPP4B增强PI3K信号[7]。目前已证实mTOR在胃癌[8]、乳腺癌[9]及肺癌[10]等多种肿瘤中表达上调。林凯煌等学者采用CCK-8法检测不同浓度的mTOR抑制剂AZD2014(10、100、500、1000 nmol/L)对肝癌细胞增殖的作用，结果显示10、100、500、1000 nmol/L的AZD2014均可显著抑制肝癌细胞的增殖能力，抑制程度与其浓度呈正相关(P<0.05)[11]。本研究发现，mTOR在乙肝相关性肝癌组织中表达率高于癌旁组织，经χ2检验差异有统计学意义。可见mTOR参与了乙肝相关性肝癌的发生。本研究通过分析mTOR与乙肝相关性肝癌临床病理参数的关系，发现mTOR表达与分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关，可见mTOR参与了乙肝相关性肝癌的发展。

HBx蛋白是一种能够调节转录、影响多种信号转导通路、促进细胞增殖及干扰DNA修复等多功能的调节蛋白[12]，该蛋白是一个能够引发肝癌的潜在机制，涉及到其在细胞内的分布情况。病理组织学检测结果表明，HBx蛋白在机体受到HBV感染的不同阶段会出现不同的分布特征。在原发性肝细胞癌病例中能够检测到强烈弥散的核内反应，在急性或慢性的乙型肝炎病例中，则会出现局灶的胞浆和核内分布[13]。通过体外实验的结果，证实在培养细胞的胞质和核内都能检测到HBX蛋白的相关表达，在核内的表达强度较弱，并发现HBX在胞质内能够激活信号传导通路，在核内能够反式激活转录成分[14]。而本研究发现，HBx主要定位于细胞膜或细胞质内。范丽等[15]研究发现，HBx能够促进肝癌细胞HepG2株中增殖、侵袭及血管新生分子的表达。本研究用免疫组织化学方法证实HBx蛋白在乙肝相关性肝癌组织中的表达高于癌旁组织，差异有统计学意义。本研究还发现HBx蛋白与分化程度、TNM分期及淋巴结转移有关。可见HBx蛋白与乙肝相关性肝癌的发生发展密切有关，这一点与既往研究一致[16]。而对于HBx蛋白在肝癌中的发病机制尚未完全明确，HBx可通过反式激活作用促进白细胞介素18(IL-18)的表达，以Fas/FasL通路诱导细胞凋亡[17]。体外实验表明，HBx还能通过激活Wnt/β-catenin、NF-κB、TGF-β等细胞信号传导通路中参与肝癌细胞侵袭转移[18]。本研究发现，mTOR和HBx经Spearman分析，两者表达呈正相关(r=0.644，P=0.000)。现推测HBx可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路参与了肝癌的侵袭转移。既往研究表明，Hippo信号通路可以介导PTEN通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝细胞肝癌细胞增殖和成瘤[19]。而王庆亮研究发现下调mTOR表达能提高人肝癌细胞SMMC-7721的热疗敏感性,其作用机制可能与诱导细胞凋亡及S期生长阻滞有关[20]。可见mTOR通过不同的信号途径参与了肝癌的侵袭与发展。随访结果显示，mTOR、HBx蛋白高表达组中位生存时间为13个月，低表达组中位生存时间为27个月，经Log-rank检验分析比较差异有统计学意义(P=0.031)。可见mTOR和HBx还与预后密切相关。

综上所述，我们可以发现mTOR、HBx蛋白相互作用共同参与了乙肝相关性肝癌的发生与发展，且与患者预后有关，为肝癌的治疗提供了新的靶点。但其具体机制尚待今后细胞学及动物模型实验进一步研究证实。