血清NLRP3炎性小体、IL-18、IL-1β水平与肝硬化、肝癌的相关性分析

杨 龙，彭 伟，张洪涛，查 元，师 婷，李 琳

原发性肝癌是临床常见恶性肿瘤，早期无明显症状体征，随着病情发展可出现肝区疼痛、消化道症状及肝大等，恶性程度高，易复发和转移，大部分患者发现时已属中晚期，严重危及患者生命安全[1-3]。本病主要病因是病毒性肝炎及肝硬化，据统计在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者中原发性肝癌发生率为10%～20%[4]。目前临床常采用甲胎蛋白和超声筛查早期肝癌，但前者灵敏度较低，后者对操作者经验水平要求较高[5]。病理检查虽是诊断肝癌的金标准，但成本较高，可重复性较差，且具有一定创伤性[6]。因此寻找敏感性较高的预测指标至关重要。近年来，炎症体及下游炎性因子在肝硬化及肝癌中的作用备受关注，炎症体是核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体及其形成的多蛋白水解复合物，在多种疾病发生、发展中具有重要作用[7]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体是宿主先天免疫系统的重要组成部分，参与抵抗病原体。白细胞介素是由单核、巨噬及淋巴细胞分泌的炎性因子，在炎症反应中具有重要作用[8]。白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)是NLRP3炎性小体分泌的炎性因子，其中IL-18可促进肥大细胞、T细胞及嗜酸粒细胞分泌Th2，增强免疫应答；IL-1β可促进嗜酸粒细胞聚集，并维持相关细胞因子水平[9]。但目前肝硬化及肝癌发病过程中的细胞分子激活机制和炎症激活后启动组织细胞的损伤机制仍不清楚。为深入了解血清NLRP3炎性小体、IL-18、IL-1β水平与肝硬化、肝癌的关系，本研究检测肝硬化、肝癌患者血清NLRP3炎性小体、IL-18、IL-1β水平，以期为临床诊断提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年2月—2020年2月我院肝胆外科收治的70例肝硬化患者(肝硬化组)和60例肝癌患者(肝癌组)，另选取同期于我院体检的50例健康者作为健康组。纳入标准：经病理检查或符合“原发性肝癌诊疗规范”[10]中相关诊断标准确诊为肝癌者；经病理检查或符合《慢性乙型肝炎防治指南》[11]中相关诊断标准确诊为肝硬化者；年龄30～75岁者；未经手术及药物治疗者；临床资料完整者。排除标准：严重心、肺功能不全者；合并其他恶性肿瘤者；合并认知障碍者；临床资料不完整者。肝硬化组中男40例，女30例；年龄31～74(50.06±6.28)岁；病程(4.78±0.60)年。肝癌组中男36例，女24例；年龄30～72(51.27±6.30)岁；病程(4.32±0.56)年。健康组中男31例，女19例；年龄30～75(50.06±6.28)岁。3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过我院医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

1.2研究方法 采集3组患者空腹静脉血4 ml，保存于EDTA抗凝管中待测。

1.2.1血清NLRP3炎性小体、IL-18、IL-1β水平测定：3000 r/min离心4 min，分离上清液后采用酶联免疫吸附法测定血清NLRP3炎性小体、IL-18、IL-1β水平。

1.2.2NLRP3 mRNA表达量测定：肝素抗凝，离心分离出血清后采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测。加入淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞，加入1 ml Trizol混匀后按照说明书提取总RNA，加30 μl无RNA酶水溶解沉淀，得到RNA溶液。建立20 μl的反转录体系，反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，终止反应。产物cDNA置于-20℃环境保存备用。建立25 μl的反应体系，反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，得到扩增曲线；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s后得到溶解曲线。每个标本做复孔，Ct差值<0.5。

1.2.3肝功能指标测定：采用罗氏全自动化学发光分析仪测定丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)水平。

1.2.4相关性分析：采用Spearman相关分析探讨肝癌组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-18、IL-1β水平与肝功能指标的相关性。

2 结果

2.13组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-18、IL-1β水平比较 肝癌组和肝硬化组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-1β水平高于健康组，肝癌组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-1β水平高于肝硬化组，差异有统计学意义(P<0.05)；肝癌组和健康组血清IL-18水平低于肝硬化组，健康组血清IL-18水平高于肝癌组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-18、IL-1β水平比较

2.23组肝功能指标比较 肝癌组和肝硬化组ALT、TBIL、AST及GGT水平均显著高于健康组，肝癌组ALT、TBIL、AST及GGT水平高于肝硬化组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组肝功能指标比较

2.3肝癌组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-18、IL-1β水平与ALT、TBIL、AST及GGT的相关性 Spearman相关分析显示，肝癌组NLRP3 mRNA表达量与ALT、TBIL、AST及GGT水平呈正相关(P<0.05)；血清IL-18水平与TBIL、AST及GGT水平呈正相关(P<0.01)，与ALT水平呈负相关(P<0.05)；血清IL-1β水平与TBIL、AST水平呈正相关(P<0.05)，与ALT、GGT水平呈负相关(P<0.05)。见表3和图1。

图1 肝癌组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-18、IL-1β水平与ALT、TBIL、AST及GGT的相关性散点图

表3 肝癌组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-18、IL-1β水平与ALT、TBIL、AST及GGT的相关性

3 讨论

流行病学研究显示，15%的肿瘤是由慢性感染性炎症诱发，如慢性支气管炎可增加患肺癌风险；肝炎和肝硬化可增加患肝癌风险[12]。HBV感染可致慢性肝脏炎症，并诱发肝癌。报道显示肝癌患者5年生存率约为50%[13]。故抑制慢性病毒性肝炎及肝硬化患者疾病进展对改善患者预后非常重要。

NLRP3炎性小体是大分子多蛋白复合体，NLRP3激活后可发生自身寡聚化，并在衔接蛋白ASC作用下形成NLRP3炎性复合体[14]，进而使pro-caspase-1剪切为有活性的caspe-1并切割其底物，以促进IL-1β、IL-18成熟，进而诱发炎性因子释放[15-17]。同时炎性细胞可吞噬和凋亡肝脏上皮细胞，并损伤和破坏肝脏上皮细胞线粒体完整性，进而加速肝功能恶化[18]。IL-18是由活化巨噬细胞产生的多功能细胞因子，可诱导免疫细胞增殖并增强其活性，促进多种细胞因子产生和分泌，同时也可致免疫损伤，使淋巴细胞数量上升，增强免疫防御效应[19]。IL-1β是具有免疫调节功能的炎性因子，可促进T、B细胞活化、增殖及分化，同时可促进肝细胞生长因子合成，并诱导血管新生，上调COX-2表达，促使肝癌发生[20]。本研究结果显示，肝癌组和肝硬化组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-1β水平高于健康组，与董德嘉等[21]报道一致，说明肝硬化和肝癌患者体内存在NLRP3、IL-1β分泌调节紊乱，分析原因可能为NLRP3、IL-1β均可激活T、B细胞激发自然杀伤和单核细胞活性，与抗原结合及病毒感染后可改变肝细胞膜成分，致肝细胞坏死及功能异常。而肝癌组血清IL-18水平低于健康组，提示肝癌患者IL-18水平下降可能与免疫功能下降有关，故提高血清IL-18水平可增强机体抗肿瘤免疫能力。且肝硬化组血清IL-18水平高于健康组，可能是因肝硬化患者肝细胞解毒功能和排泄能力下降导致IL-18无法正常代谢所致。同时本研究发现，肝癌组NLRP3 mRNA表达量和血清IL-1β水平高于肝硬化组，提示NLRP3、IL-1β随病情严重程度加重而升高，原因可能为NLRP3激活后可促进IL-1β分泌，进而损伤和破坏肝脏上皮细胞，加速肝功能恶化。不同的是，肝癌组IL-18低于肝硬化组，原因可能与炎症反应和免疫功能相关，因肝癌患者自身免疫防御效应低下，致IL-18水平低表达，进一步说明NLRP3、IL-18、IL-1β水平与疾病进展具有相关性。

NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3，IL-18为白细胞介素-18，IL-1β为白细胞介素-1β，ALT为丙氨酸转氨酶，TBIL为总胆红素，AST为天冬氨酸转氨酶，GGT为谷氨酰转移酶大多数肝病、肝损伤患者肝功能指标升高，本研究结果显示，肝癌组和肝硬化组ALT、TBIL、AST及GGT水平均显著高于健康组，与谢梅和王芳[22]报道一致，说明肝炎病毒感染可导致肝功能异常，分析原因可能与宿主免疫损伤作用有关。有研究表明，AST、ALT、白蛋白与肝脏损伤程度有关[23]。本研究结果还显示，肝癌组ALT、TBIL、AST及GGT水平高于肝硬化组，提示ALT、TBIL、AST及GGT越高肝脏损害越严重。

与其他研究不同的是，本研究分析NLRP3、IL-18、IL-1β与肝功能的相关性，Spearman相关分析显示，肝癌组NLRP3 mRNA表达量与ALT、TBIL、AST及GGT水平呈正相关；血清IL-18水平与TBIL、AST及GGT水平呈正相关，与ALT水平呈负相关；血清IL-1β水平与TBIL、AST水平呈正相关，与ALT、GGT水平呈负相关。提示血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平与肝功能具有一定的相关性，可作为评估肝癌预后的有效指标。但本研究纳入对象数量较少，且为回顾性研究，结果可能存在一定偏倚，今后将扩大样本量进行前瞻性研究，进一步分析血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平与肝癌的相关性。

综上所述，血清NLRP3、IL-18、IL-1β水平与肝硬化进展存在相关性，NLRP3、IL-1β随疾病严重程度而升高，病程进展至肝癌时IL-18表达降低。