氮磷钾不同比例对油茶幼林根际土壤细菌群落结构的影响

黄 眯，辛伟年，雷小林,，张志能，叶雄英，孙 颖★

(1.江西农业大学林学院，江西 南昌330045；2.江西省林业科学院·木本油料与香精香料工程中心，江西南昌330013；3.定南县林业局，江西 赣州341900；4.江西交通职业技术学院，江西 南昌330013）

微生物群落是凋落物残体分解、土壤团聚体形成和土壤有机质稳定的主要原因[1-3]，影响着许多大量元素和微量营养素的有效性和吸收、植物疾病的类型，对植物健康和生产力至关重要的作用[4-6]。

油茶是典型的“抱子怀胎”植物，花果同期，对养分的需求量大，如不能及时供给养分容易引起土壤肥力下降，最终导致油茶产量下降[7-9]。施肥是目前生产过程中最常见的提高油茶产量的方法，不同的施肥处理会给土壤环境造成不同的影响，从而导致土壤微生物群落结构的变化[10-11]。费裕翀[12]以及王迪等[10]人的研究表明共同表明有机无机混合肥对土壤细菌和真菌的效果最佳。王华[13]的研究指出油茶专用有机肥显著增加了氨化细菌、亚硝化细菌的数量。目前关于施肥对油茶土壤微生物群落结构研究的文章较少，且大部分采用的是平板计数的实验方法，不能准确的反应土壤微生物群落结构的变化。本文旨在运用高通量测序的手段，研究氮磷钾不同比例的有机无机混合肥、有机肥对油茶幼林土壤微生物群落结构的影响，揭示施肥后各处理中的细菌群落组成及变化情况，为探究适合油茶幼林的氮磷钾比例肥料提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

研究地位于江西省赣州市定南县历市镇蕉坑村（24°32′ N，114°46′ E）进行，该地属中亚热带季风湿润气候区，四季分明，温暖湿润，光照充足，年平均气温为19 ℃，日照率为43%，全年无霜期近300 d。试验地油茶品种为长林系列，2015年种植，植株健康状况良好，无病虫害。试验前土壤pH 5.08，全磷2.30 g·kg-1、全氮15.87 g·kg-1、全钾1.85 g·kg-1、锌11.66 mg·kg-1、镁1.52 g·kg-1、钙2.71 g·kg-1、硼0.13 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验于2019年4月进行，试验设置5 个处理，根据生产中的经验，在有机肥中添加不同质量的尿素、磷酸二铵、硫酸钾，构成的氮磷钾不同比例肥料配方，详见表1。有机肥由锐源生物科技有限公司提供，处理中所使用的尿素、磷酸二铵、硫酸钾均购自当地肥料店。每个配方施30 棵，施肥采用穴施法，距离主干30 cm 处挖取深30 cm 左右的深的沟，统一施在油茶树的北侧，并及时覆土。

表1 试验处理及肥料施用量Tab. 1 Test treatment and fertilizer application amount

1.3 土壤样品采集及测定

2019年7月进行样品采集，每个处理20 棵，用取样器采集10～30 cm 左右的油茶根际土壤，剔除石砾和和杂草后将每个处理的土壤等量混合按四分法分为2份，一份放入液氮罐中保存，另一份装入无菌袋中带回实验室用于测量土壤化学性质，土壤化学性质的测定方法参照《中华人民共和国林业行业标准LY/T－1999》[14]，16S rDNA、PCR 产物高通量测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.4 数据处理

利用基迪奥的OmicShare 云平台进行α、β 多样性分析。用SPSS 20.0、Excel2010 统计基础数据，R studio 1.2.1335 版完成热图、维恩图、物种组成图、网络关系图的绘制。

2 结果与分析

2.1 土壤化学性质

从表2 中可以看出，施肥处理后，土壤全氮、速效钾、全钾含量都极显著提高（P＜0.01）。其中全钾（TK）含量是不施肥的3.11～4.46 倍、速效钾（AK）含量是不施肥处理的3.17～4.01 倍，Y2、Y4处理的土壤有机质（OM）含量高于对照，Y1处理的pH 与对照具有极显著差异，总磷含量中只有Y2处理比对照低1.88 g·kg-1，其余处理均极显著高于对照。碱解氮（AN）含量分别提高了58.67%、77.77%、164.14%、111.73%，除Y1处理的有效磷（AP）含量比对照低0.10 mg·kg-1，Y2、Y3、Y4有效磷（AP）含量分别高出对照0.37 mg·kg-1、0.13 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1。

表2 土壤化学性质Tab. 2 Chemical properties of soil

2.2 细菌群落分析

从图1 可以看出，5 个处理拥有相同的OTU 数量为1 051 个，其中Y1处理的特有微生物数量最多742 个，CK、Y4、Y3、Y2处理的特有OTU 分别为649个、638 个、589 个、565 个。从OTU 总量上来看Y（13 268 个）＞Y（43 241 个）＞Y（23 197 个）＞Y（33 109 个）＞CK（3 020 个），表明施肥处理提高了土壤细菌的OTU数量，且每个处理的细菌OTU 组成都具有一定的差异性，Y1处理下的细菌群落丰度和多样性优于其他处理。

图1 油茶根际土壤细菌OTU 数量Fig. 1 The number of OTUs in the rhizospheresoil of C.oleifera

2.3 优势细菌分析

利用QIIME 软件分析各个处理的菌群组成结构，绘制成图2。从图中可以本次试验中油茶林地的主要菌落为以下7 个：放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes）以及未知菌门。其中放线菌门、绿弯菌门、变形菌门、酸杆菌门这四个菌群相对丰度之和均大于80%，是油茶林地中的主要菌门。各个处理优势细菌有所不同，CK、Y1、Y2的优势菌种为绿弯菌门，而Y3、Y4的优势菌种为放线菌门。Y1、Y2、Y3、Y4处理的放线菌门所占比例分别比对照高出15.29%、13.03%、32.96%、30.82%，Y2、Y3、Y4处理的绿弯菌门比对照分别下降了7.42%、24.5%、23.75%，未知菌门比例也显著下降。在进行聚类热图分析时（图3），可以看出CK 和Y2首先聚为一类，再与Y1聚成第二类，与Y3、Y4处理关系较远。因此可以看出施肥对油茶林地土壤微生物群落结构具有影响，不同的施肥处理影响的菌门也不同，其中Y3处理的放线菌门、Y1处理的绿弯菌门变化最为显著。

图2 油茶根际土壤细菌门水平的群落结构Fig. 2 Community structure of Bacteroides in the rhizosphere soil of C. oleifera

图3 油茶根际土壤细菌门水平聚类热图Fig. 3 Horizontal clustering heat map of bacterial phylum in the rhizosphere soil of C. oleifera

表3 油茶根际土壤细菌α 多样性指数Tab. 3 Diversity index of bacteria α in the rhizosphere soil of C. oleifera

2.4 不同处理对土壤微生物α 多样性的影响

从表3 中可以看出，测序后的数据经过筛查得到各处理的序列数总和为440 749，其中Y1的序列数97 090 为所有处理最高，Y4的序列数比对照低7 052。Sobs 指数是对观察到的OTU 的直观数量统计，Chao1指数和ACE 指数反应土壤微生物物种丰富度。Shannon 指数和Simpson 指数与土壤微生物物种的丰富度以及均匀度正相关。从表中可以看出施肥处理提高了Chao1 和ACE，其中Y1处理的Chao1 指数、Y4的ace 指数分别比对照提高了19.2%、20.3%；除Y2处理外，其余处理的shannon 指数较对照有所下降。可以得出不同的氮磷钾比例处理会对油茶幼林土壤细菌落丰度和多样性产生影响，其中Y1处理的丰度及多样性优于其他处理。

2.5 β 多样性指数分析

基于OTU 水平对不同处理的细菌群落结构进行主坐标分析（PCoA），由图4 可知，PC1、PC2 的解释度分别为84.12%和14.73%，总解释度达到98.85%。除Y2与CK 处理在同一个象限外，其余处理均聚类于不同象限，说明不同施肥显著改变了细菌群落结构。

2.6 细菌群落结构与土壤化学性质的关系

对土壤细菌与土壤化学性质进行相关性分析得到表 4， 从 表 4 中发现 AN 与放线菌 门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）呈显著正相关关系，AK、TK 均与浮霉菌门（Planctomycetes）呈显著负相关关系，其余环境因子对土壤细菌优势门有影响，但未达到显著相关。绿弯菌门（Chloroflexi）仅与土壤pH 为正相关关系，与其他土壤化学性质均为负相关；变形菌门（Proteobacteria）与OM 和AP 呈正相关；酸杆菌门（Acidobacteria）与OM、pH 为负相关；疣微菌门（Verrucomicrobia）除与pH、TP 为负相关外，与土壤其他化学性质均为正相关；浮霉菌门（Planctomycetes） 与TN、OM、pH、TP、AN、AP 均呈负相关关系。

图4 油茶根际土壤细菌群落PCoA 聚类图Fig. 4 PCoA cluster of bacterial communities in the rhizosphere soil of C. oleifera

表4 油茶根际土壤细菌门水平群落结构与土壤化学性质相关性分析Tab. 4 Correlation analysis of community structure of bacteroidea and soil chemical properties in the rhizosphere soil of C.oleifera

3 讨论

3.1 施肥对土壤细菌数量的影响

土壤生态平衡离不开细菌的多样性[15]，不同的施肥处理改变了土壤细菌的多样性，试验的OTU 结果显示Y1 处理的OTU 总量以及特有OTU 数量均为所以处理中最高，不施肥（CK）处理的OTU 总量最低，这个结果可能是因为施用有机无机复合肥之后土壤有机质含量上升，为微生物的生长提供了良好的生长环境，其次有机肥中本身携带有大量的微生物，某些特有微生物可能是有机肥中的微生物，例如纤维杆菌门门，纤维杆菌门只有一个纤维杆菌属，该属菌种生活在反刍动物的瘤胃中[16]；软壁菌门属于革兰氏阳性菌，常在新鲜猪粪中被检测到[17-18]。微生物的α 多样性中的Simpson 揭示了物种的均匀度，CK 的Simpson的系数最高，表示施肥处理会降低土壤微生物的均匀度，这个结果与李想[19]的研究结果相似。

3.2 施肥对土壤细菌群落组成的影响

本研究应用Illumina 高通量测序技术，分析了不同施肥处理的土壤细菌群落结构变化特征。结果表明，各处理中的放线菌门、绿弯菌门、变形菌门、酸杆菌门相对丰度之和大于80%，是油茶林地中的主要菌门，这与吴泽龙、费裕翀[12,20]的研究结果一致。Y1、Y2、Y3、Y4处理显著增加了放线菌门的比例，其中Y3、Y4这两个处理中放线菌门成为优势菌门。放线菌门大多为腐生富营养菌，生态位较宽且大部分是有益菌, 对某些病原菌会产生拮抗作用，广泛分布于各类土壤之中[21-23]，王伏伟[24]研究认为土壤全氮含量是提高放线菌门相对丰度的重要原因，这与本试验的研究结果相同，本试验还发现放线菌门的提高不仅与全氮有关，还与碱解氮呈显著的正相关关系。绿弯菌门的增加有助于有机物的分解，促进营养元素的循环[25-26]，本研究中绿弯菌门发现与土壤pH 呈正相关，这一结论与姚兰等人[27]的研究结果相同。酸杆菌门与碱解氮呈显著正相关关系。Yin 的试验结果表明根际土壤中酸杆菌门增加可能与土壤抑病相关[28]。

4 结论

本研究采用高通量测序技术研究了氮磷钾不同比例有机无机复合肥、有机肥、不施肥处理下的油茶根际土壤细菌多样性，结果表明有机复合肥、有机肥处理显著增加了土壤微生物细菌的多样性。在微生物群落的组成上，放线菌门、绿弯菌门、变形菌门、酸杆菌门这4 个菌群相对丰度之和均大于80%，是本试验中油茶根际土壤中的主要菌门。本研究中AN、AK、TK 是对土壤细菌产生显著影响的3 个环境因子。在油茶幼林中，有机肥和化肥按照合理的比例适量的施用，在改善土壤化学性质的同时，还提高了土壤细菌的数量，本研究中，Y1处理下土壤细菌的丰度为所有处理中最高。