基于指纹图谱、化学计量学、网络药理学的半夏汤洗前后质量评价

张梦晨，谢 辉，陆兔林，何 畅，毛春芹，冯 飞，蒋孝峰

南京中医药大学药学院，江苏 南京 210046

半夏系天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥块茎，辛温，归肺、脾、胃经；可燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结。临床用于湿痰寒痰、咳喘痰多、痰饮眩悸、风痰眩晕、痰厥头痛、呕吐反胃、胸脘痞闷、梅核气等病证的治疗[1]。半夏是临床常用有毒中药，《神农本草经》将其列为下品，内服时均以炮制品入药。吴皓[2]研究并分析了汉代至宋代半夏的炮制方法沿革，结果表明汤洗、姜制是半夏的基本炮制方法，也是其他诸多半夏炮制工艺演变的基础。

《伤寒杂病论》中含有半夏的42首方剂中，半夏下方标注“洗”字共18首[3]，占含半夏方剂数的42%，可见汤洗半夏的使用频率之高。2018年4月国家中医药管理局发布了《古代经典名方目录（第一批）》，其中含半夏的9首汉代仲景方中5首明确标注半夏的炮制方法为“洗”。张仲景在《金匮玉函经·方药炮制》中给出“洗”的解释：“凡半夏不咀，以汤洗十数度，令水清滑尽。洗不熟有毒也。”关于“汤”的界定，《说文解字》曰：“汤，热水也”。半夏汤洗即将半夏药材置于新沸的热水中反复泡洗至洗后的水清澈、半夏表面无涎滑物质。有研究表明，半夏经过“汤洗”后对黏膜的刺激性降低[4]。

项目组在前期对半夏泻心汤、旋覆代赭汤、黄连汤[5-6]等经典名方开展的研究工作中发现，由于制剂成分复杂，半夏在制剂中尚缺乏有效的质量评价手段，因此完善半夏药材及汤洗饮片的质量评价方法，控制药材及饮片质量，配合制剂过程管理，有助于建立含有半夏饮片的复方制剂质量控制体系。

指纹图谱技术常用于表征中药化学成分的整体性、复杂性和成分变化的差异性，本研究采用HPLC法构建指纹图谱，结合主成分分析（principal component analysis，PCA），对国内主要产区半夏进行分析与评价；同时，采用模式识别方法对汤洗前后半夏进行判别分析，探寻半夏汤洗前后化学成分变化，以期发现和明确区分半夏及汤洗半夏的质量控制指标。进一步结合网络药理学分析相应成分所涉及的靶点与通路，为半夏的质量控制及后续开发研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，含2998 DAD检测器，全自动进样器，Empower液相色谱工作站，上海沃特世科技有限公司；TGL-16C高速离心机，上海安亭科学仪器厂；CAV64C电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试药

乙腈、甲醇，色谱纯，美国天地有限公司；水为超纯水。对照品次黄嘌呤（批号140661-201704，质量分数100.0%）、黄嘌呤（批号140662-200802，质量分数98.0%）、尿苷（批号110887-201803，质量分数99.5%）、腺嘌呤（批号110886-201102，质量分数99.4%）、琥珀酸（批号110896-201602，质量分数98.0%）、肌苷（批号140669-201606，质量分数98.0%）、鸟苷（批号111977-201501，质量分数93.6%）、腺苷（批号110879-201703，质量分数99.7%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品胸苷（批号18042703，质量分数98.0%）购自南京金益柏生物科技有限公司。

13批半夏药材经南京中医药大学陈建伟教授鉴定，均为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.的干燥块茎，信息见表1。

表1 不同产地半夏药材信息Table 1 Sample information of Pinelliae Rhizoma (PR)from different producing areas

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～7 min，0～0.5%乙腈；7～20 min，0.5%～1.0%乙腈；20～25 min，1.0%～1.5%乙腈；25～40 min，1.5%～5.5%乙腈；40～45 min，5.5%～10.0%乙腈；45～50 min，10.0%～15.0%乙腈；50～60 min，15.0%～26.0%乙腈；60～65 min，26.0%～60.0%乙腈；65～85 min，60.0%～100.0%乙腈；体积流量1.0 mL/min；检测波长260 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取本品细粉，约2 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，精密加入20 mL超纯水，称定质量，超声45 min，放冷，超纯水补足减失的质量，滤过，离心，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、胸苷、腺苷、琥珀酸对照品适量，加入适量超纯水，配制成质量浓度分别为113.2、46.6、77.8、109.4、45.2、27.5、191.0、195.5 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次，以9号峰（尿苷）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示各项RSD值均小于3%，表明该仪器具有良好的精密度。

2.4.2 重复性试验 按“2.2”项下方法制备供试品溶液（S1）6份，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，进行6次平行测定，以9号峰（尿苷）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示各项RSD值均小于3%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4.3 稳定性试验 精密称取样品（S1），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、16、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，以9号峰（尿苷）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示各项RSD值均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 半夏药材指纹图谱研究

2.5.1 指纹图谱的建立及主要色谱峰的指认 取13批半夏样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，将260 nm处色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”（2012版），设定S1样品色谱图为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，经全峰匹配后得到半夏的共有模式图和指纹图谱叠加图，见图1-A、B，S1～S13相似度计算结果分别为0.990、0.991、0.996、0.988、0.975、0.984、0.951、0.980、0.981、0.988、0.974、0.983、0.969，相似度为0.951～0.996。取“2.3”项下的对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定，得到对照品溶液液相色谱图，见图1-C。

图1 13批半夏药材的HPLC指纹图谱 (A)、共有模式图(B) 和混合对照品HPLC图 (C)Fig.1 HPLC fingerprint (A) and common pattern (B) of 13 batches of PR and HPLC of mixed reference substances (C)

本研究建立了半夏药材的指纹图谱，共标记20个共有峰，经对照品保留时间及紫外吸收图谱指认，确定7～10、13、14、20号色谱峰分别为次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷和琥珀酸。尿苷的色谱峰（9号峰）保留时间适中，峰形对称，分离度较好，故以其作为参照峰，计算得到各共有峰保留时间的RSD＜0.76%，表明各色谱峰出峰稳定。分别为将各个共有峰的峰面积相对于参照峰的峰面积进行量化，得到20×13阶数据矩阵，见表2。由于不同批次的半夏中肌苷含量差异较大且峰面积较小，色谱图中肌苷对应的色谱峰（i号峰）未被指认作为半夏指纹图谱的共有峰。

表2 13批半夏药材共有峰相对峰面积Table 2 Relative peak area of 13 batches of PR

2.5.2 PCA PCA将多个变量转化为少数几个综合变量（即主成分），是一种有效的降维统计方法，该方法消除了评价指标间的相关影响，有助于更客观地描述样品的相对地位，这对于半夏药材质量的综合评价具有重要意义。采用SPSS21.0统计软件，将13批样品中20个成分的相对峰面积组成矩阵，数据经标准化处理后进行PCA。PCA中特征值及贡献率见表3。由表3可见，前5个主成分的特征值均大于1，表明前5个主成分在半夏药材质量评价中起主导作用，5个主成分的累积贡献率达90.928%（＞90%），能较客观地反映不同产地半夏药材的综合质量，故选取前5个主成分进行分析。

表3 旋转后的主成分特征值及贡献率Table 3 Rotated eigenvalue of principal component and contribution rate

每个主成分包含的各因子其载荷系数综合反映了所测成分对各主成分的影响。由表4可知，1、4、7（次黄嘌呤）、18、19、20（琥珀酸）号峰对主成分1有明显的正负荷；12、16、17号峰是主成分2的主要决定因子，此外，10（腺嘌呤）号峰对主成分2有较强的逆负荷；6、11号峰的载荷因子在主成分3中较大；8（黄嘌呤）号峰是对主成分4影响较大的特征向量，此外，10（腺嘌呤）、15号峰对主成分2有较强对逆负荷；2、13号峰的载荷因子在第5主成分中较大，说明上述化合物对半夏药材的品质影响较大，其余色谱峰对半夏药材的品质影响较小。

表4 主成分荷载Table 4 Load matrix of principal component

不同产地半夏样品的主成分各因子总得分见表5，可根据各主要因子的权重系数计算得出各样品的综合得分。权重系数依据其方差贡献的大小计算，即各主成分的贡献率与5个主成分的总贡献率之比，主成分1的权重为36.864%/90.928%＝0.405 4，同理可得主成分2、3、4、5的权重分别为0.223 6、0.144 9、0.113 6、0.112 6。各主成分因子得分与其权重乘积之和相加，得出各半夏样品的总因子得分（F），其表达式为F＝0.405 4F1＋0.223 6F2＋0.144 6F3＋0.113 6F4＋0.112 6F5，其值越高，综合质量越好。结果显示，S6批样品（甘肃陇南）综合质量最好，S12（江苏泰州）综合质量次之。

表5 不同产地半夏药材的主成分因子及品质综合评价Table 5 Principal component factors and comprehensive quality evaluation of PR from different producing areas

2.6 汤洗半夏指纹图谱研究

2.6.1 汤洗半夏的制备 取净半夏药材，加水浸泡至内无干心后弃去全部水液，加入5倍量新沸的热水，浸泡搅拌10 min，弃去水液及漂浮物，如此反复拌洗7次，取出，干燥，即得。13批半夏药材S1～S13汤洗后对应饮片编号为T1～T13。

2.6.2 汤洗半夏指纹图谱的建立 取13批汤洗半夏饮片，以“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，将260 nm处色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”（2012版），设定S1样品色谱图为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，经全峰匹配后得到汤洗半夏饮片的指纹图谱叠加图和共有模式图，见图2，图2中共有峰的编号系根据半夏药材指纹图谱中对应共有峰号编制。汤洗半夏饮片T1～T13相似度计算结果分别为0.978、0.977、0.993、0.993、0.940、0.988、0.995、0.984、0.983、0.997、0.961、0.989、0.991，相似度介于0.940～0.997。

图2 13批汤洗半夏的HPLC指纹图谱叠加图 (A) 和共有模式 (B)Fig.2 HPLC fingerprint (A) and common pattern (B) of 13 batches of wPR

与半夏药材相比，经汤洗处理后，指纹图谱中某些共有色谱峰峰面积减小甚至消失，仅余11个共有峰，分别对应半夏药材指纹图谱共有峰中的3、4、6、7、9～11、14、17、18、20号峰。经对照品保留时间及紫外吸收图谱指认，确定7、9、10、20号色谱峰分别对应为次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤和琥珀酸。分别为将各个共有峰的峰面积相对于参照峰（9号峰）的峰面积进行量化，得到11×26阶数据矩阵，比较半夏及汤洗半夏共有峰的相对峰面积，结果见表6。

2.6.3 PCA 将13批半夏、汤洗半夏共有峰的相对峰面积导入SIMCA-P14.1软件，以10个共有峰的相对峰面积为变量，PCA得分图见图3。半夏与汤洗半夏在主成分空间分布上均有特定区域，说明半夏与汤洗半夏化学成分存在显著差异，能够实现半夏与汤洗半夏的区分。

2.6.4 正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）与差异性成分分析 在PCA的基础上选择有监督模式的OPLS-DA，模型主成分回归系数：R2X＝0.683，R2Y＝0.724，Q2＝0.64＞0.5，说明预测模型有效，半夏与汤洗半夏可以得到有效区分，如图4。模型得到变量重要性投影（variable importance projection，VIP）值，见图5。VIP值越大，即变量离X轴越远，表明该色谱峰对于半夏与汤洗半夏的分类贡献越大，也是导致半夏与汤洗半夏相区分的差异成分。其中VIP＞1的有4个色谱峰，依次为11、10、18、20号，其为导致差异的主要标志物。其中10号峰为腺嘌呤，20号峰为琥珀酸。其余色谱峰均＜1，对于区分半夏和汤洗半夏意义不大。

2.7 网络药理学研究

2.7.1 候选化合物靶点预测 核苷类成分和有机酸是半夏中主要的2类成分，已有许多研究报道证实这些成分是半夏的功效关联物质[7-8]。检索中药系统药理数据库（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem Compound数据库（https://www.ncbi.nlm.

nih.gov/pubmed/）、Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、胸苷、腺苷和琥珀酸8个化合物，候选化合物作用的靶点；并通过Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）将预测出的靶点蛋白名转换为对应的基因名。将各数据库筛选出的靶点蛋白合并，除去重复靶点，最终得到与8个化合物相关的229个靶点蛋白。

表6 半夏-汤洗半夏指纹图谱共有峰的相对峰面积Table 6 Relative common peak area of PR and wPR

图3 半夏与汤洗半夏PCA得分图Fig.3 PCA score chart of PR and wPR

图4 半夏与汤洗半夏OPLS-DA得分散点图Fig.4 OPLS-DA scatter plot of PR and wPR

图5 半夏、汤洗半夏指纹图谱共有峰VIP值Fig.5 VIP values of fingerprint common peaks of PR and wPR

2.7.2 靶点蛋白与蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络分析 将获得的229个靶点蛋白以gene symbol形式导入在线String 11.0软件（https://string-db.org/cgi/input.pl），物种选择为人（homo sapiens），最高置信度蛋白交互参数评分值＞0.9，其他参数设置不变，将得到的相互作用参数导入Cytoscape 3.6.0软件构建PPI网络图，去掉网络中的单一节点，见图6。

图6 PPI网络Fig.6 PPI network

对PPI进行拓扑特征分析，选取在度中心性（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）3个参数均大于中位数且degree≥9的点作为核心靶点，经筛选后共得到9个重要核心靶点，具体包括MAPK1（degree 15）、RAC1（degree 10）、CASP3（degree 10）、MAPK3（degree 10）、CCND1（degree 9）、CDK2（degree 9）、SRC（degree 9）、PNP（degree 9）、EGFR（degree 9），且发现这9个靶点主要与腺苷、腺嘌呤、肌苷、尿苷、次黄嘌呤有关。

2.7.3 功能富集分析与通路分析 利用David 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对9个潜在的核心靶点蛋白进行交集靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶点的功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能。KEGG富集分析可以得到潜在靶点所富集的信号通路。GO分析以P＜0.05表示具有统计学意义。在GO富集分析中，共获取19个GO条目，其中生物过程（biological process，BP）占10个，分子功能（molecular function，MF）占1个，细胞组成（cellular component，CC）占8个，选择P值＜0.05的条目进行展示，GO分析结果提示BP显著富集在长波紫外光（long wave ultraviolet ray，UV-A）反应、乳腺上皮细胞增殖、底物黏附依赖性细胞扩散和G1/S过渡有丝分裂细胞周期等过程；MF主要富集在ATP结合；CC主要富集在胞质、周期蛋白依赖的蛋白激酶全酶复合、早期内体膜等过程。具体信息见表7。

KEGG富集分析得到73条通路，结果见表8。选择关联基因数大于等于5的的条目进行展示，富集到16条通路主要涉及癌症中的病毒致癌（viral carcinogenesis）、蛋白聚糖作用癌症（proteoglycans in cancer）、癌症通路（pathways in cancer）、乙型肝炎（hepatitis B）、黏着斑（focal adhesion）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路等，结果表明这9个核心靶点可能主要通过调控这些通路达到干预疾病的目的。

2.7.4 成分-靶点-通路网络构建 根据上述成分-靶点、靶点-通路的对应关系，利用Cytoscape3.6.0软件绘制出成分-靶点-通路网络图，并通过网络图进行可视化展示，见图7。由网络图可知，半夏是通过多靶点、多途径发挥协同作用的。根据Cytoscape3.6.0软件分析结果，以化合物、靶点蛋白、信号通路的连接度（degree）为参考，发现化合物腺苷（degree 73）、肌苷（degree 38）的连接度较高，提示这2个化合物可能是半夏的活性成分，MAPK1（degree 16）、CCND1（degree 13）、ADORA1（degree 6）、ADORA2A（degree 6）、ADORA3（degree 5）、PNP（degree 5）的连接度高于其他靶点，表明这6个靶点发挥的作用可能更为关键，蛋白聚糖作用癌症（degree 7）、癌症通路（degree 7）、病毒致癌（degree 7）、PI3K-Akt信号通路（degree 6）、乙型肝炎（degree 6）、黏着斑（degree 6）连接度高于其他通路，表明半夏的7个关键成分主要对上述6条信号通路发挥重要作用。

表8 主要作用靶点的通路富集分析Table 8 Enrichment analysis of main target pathways

图7 半夏成分-靶点-通路网络Fig.7 Component-target-pathway network of PR

2.8 整合分析

半夏中含有生物碱类、有机酸类、核苷类、植物甾醇类、芳香酸类及半夏蛋白等多种成分，其中有机酸类和核苷类成分是半夏主要的活性成分之一，具有多种药理作用[9]。1987年从半夏中分离出鸟苷[10]，1997年分离出胸苷[11]；2003年分离出次黄嘌呤核苷[12]。有研究表明，半夏经炮制成清半夏、姜半夏、法半夏饮片后，肌苷、鸟苷、腺苷、琥珀酸含量明显降低[13]，这与本研究中识别出的差异性成分相吻合。

MAPK信号转导通路在细胞生长、分化、凋亡等进程中发挥关键作用[14]。细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CD1）经研究表明可促进细胞增殖，但其过度表达可致细胞增殖失控，促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移[15]。过表达的CD1与肝细胞癌相关。综上，推测半夏差异性成分可通过作用这些核心靶点发挥潜在的治疗机制。与半夏中核苷类成分相关度较高的通路主要为蛋白聚糖作用癌症、癌症通路、病毒致癌、PI3K-Akt信号通路、乙型肝炎、黏着斑等。通过查阅相关文献可知，半夏中总蛋白、多糖等成分对卵巢癌细胞、小鼠肉瘤瘤株S180、小鼠肝癌细胞H22、小鼠艾氏腹水癌细胞EAC等具有显著的抑制作用[16-19]。半夏中的核苷类成分是否具有抑癌协同增效作用有待进一步研究证实。

3 讨论

本实验分别建立了半夏药材和汤洗半夏饮片的HPLC指纹图谱，并指认了其中7个共有峰，半夏药材和汤洗半夏饮片的均具有较好的相似度，说明该方法简便快捷，可以稳定可靠地应用于半夏的质量控制过程中。各主成分的载荷值综合得分表明不同产地半夏药材的综合化学质量存在差异，且无明显的地域性规律，这进一步说明由于受环境、生长年限等多因素的影响，造成了半夏化学质量的差异。经汤洗处理后其中11个共有峰的色谱数据经PCA和OPLS-DA筛选后得到4种差异性成分。采用网络药理学分析相关成分，结果表明它们具有广泛的靶点和网络通路，与半夏的主要药理作用密切相关，为进一步实验验证、潜在药理学机制及临床拓展应用提供参考依据。

在文献研究基础上，指纹图谱方法建立过程中对水、20%甲醇、50%甲醇3种提取溶剂进行比较，研究发现用水超声提取45 min得到的供试液分离效果好且色谱峰数量较多；以水为提取溶剂，分离出来的成分极性较大，例如多糖类成分、核苷类成分。且超声提取一次操作简单，避免多重操作处理有助于降低精密度。

经文献查阅[20-22]，同时进行190～410 nm波长下全波长扫描，发现在260 nm处各成分均有较强吸收，色谱峰相对较多，故选择260 nm波长下进行指纹图谱分析；对Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters C18XTerra（250 mm×4.6 mm，5 μm）、汉邦Hedera ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色谱柱进行了比较，结果表明Waters C18Xselect（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱对于极性成分分离效果最佳，可以最大限度地反映半夏化学成分组成的全貌。研究中还对柱温、流动相流速、梯度洗脱程序进行了考察，最终确定了色谱条件。

来源不确定、各地炮制规范不统一、贮藏运输不当使得中药饮片的质量控制问题频出[23]，本研究采用指纹图谱技术对多个产地的半夏药材开展质量研究，初步分析了汤洗前后半夏中的差异性成分，通过网络药理学初步筛选其潜在的作用靶点和网络通路，有助于更快速地找到效应相关的质量标志物。未来还需借助适宜的化学分析技术、药效学与毒理学技术和“谱-效-毒”关联性分析研究，进一步阐明汤洗影响半夏临床使用的有效性与安全性的科学内涵。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突