液相色谱法测定饮料中日落黄、柠檬黄和胭脂红的含量

李 娟,张 彤，龙 丽

(1.绵阳师范学院化学与化学工程学院，四川绵阳 621000；2.绵阳市安州生态环境监测站，四川绵阳 622651)

0 引言

人工合成色素的检测方法有高效液相色谱法[1-5]、薄层色谱法[6]、紫外-可见分光光度法[7]、液一质联用法[8]等.很多方法包括前处理只适用于检测基质比较简单的食品[9-10]，对于一些蛋白质含量高且基质复杂的食品(如：海产品，腌制蔬菜等)却不能准确测定其中的含量，而国家标准《食品中合成着色剂的测定》 (GB/T 5009. 35-2003)[4]中规定的高效液相色谱法、薄层色谱法和示波极谱法来测定色素，这些方法前处理步骤繁琐，费时，成本高.

为了方便检测不同饮料中柠檬黄、胭脂红和日落黄的含量，本文建立了同时检测以上3种合成色素的方法，该方法适用于各类不同饮料中日落黄、柠檬黄和胭脂红的测定，适用范围广、准确、操作简便、成本低且重复性好.

1 日落黄、柠檬黄、胭脂红的介绍和含量测定的研究现状

1.1 日落黄、柠檬黄、胭脂红的简介

日落黄(sunset yellow，简称 SY)[11](图1-1)，又名食用黄色5号(日本)、食用黄色3号、橘黄、夕阳黄、晚霞黄，是一种水溶性偶氮类着色剂.化学名称为1-(4′-磺基-1′-苯偶氮)-2-萘酚-6-磺酸二钠盐，分子式为C16H10N2Na2O7S2，相对分子质量452.37，是一种常用的人工食用色素，性质稳定，价格较低，广泛用于食品和药物的着色..

柠檬黄又称酒石黄、肼黄[12](图1-2).分子式为C16H9N4O9S2Na3，化学名称为1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠盐，食用柠檬黄外观为橙黄色粉末，微溶于酒精，不溶于其他有机溶剂.主要生产原料为对氨基苯磺酸及酒石酸，由对氨基苯磺酸经重氮化，与1-(4-磺基苯基)-3-羧基-5-吡唑啉酮在碱性溶液中偶合、精制而成.大多用于食品、饮料、药品、化妆品、饲料、烟草、玩具、食品包装材料等的着色，也可以用于羊毛、蚕丝的染色.

胭脂红，又名食用赤色102号(日本)、食用红色7号、丽春红4R、大红、亮猩红[13](图1-3)，为水溶性偶氮类着色剂.分子式为C22H20O13，化学名称为1-(4′-磺酸基-1′-萘偶氮)-2-萘酚-6,8-二磺酸三钠盐，是苋菜红的异构体.胭脂红(Ponceau 4R)是目前我国使用最广泛、用量最大的一种单偶氮类人工合成色素.胭脂红作为食品色素可用于果汁饮料、配制酒、碳酸饮料、糖果、糕点、冰淇淋、酸奶等食品的着色，而不能用于肉干、肉脯制品、水产品等食品中，主要是为了防止一些不法分子通过使用色素将不良的原料肉如变质肉的外观掩盖起来，欺骗消费者.

图1 日落黄Fig.1 The sample of sunset yellow图2 柠檬黄Fig.2 The sample of tartrazine图3 胭脂红Fig.3 The sample of carmine

1.2 日落黄、柠檬黄、胭脂红含量测定的研究现状

柠檬黄、日落黄、胭脂红色素是世界上最常用的合成食用色素，在饮料调色方面起着至关重要的作用.而作为广泛应用于饮料中的合成食用色素，消费者对这些色素的超标使用和食品安全也越来越关注，推动研究学者们不断地对这几种色素的测定进行研究.

刘奋等介绍了用高效液相色谱法配合DAD检测器对柠檬黄、胭脂红、日落黄含量进行测定的方法[14]，流动相为甲醇和0.02 mol/L乙酸铵，梯度洗脱.针对各种合成色素的不同出峰时间，分别选用其最佳检测波长检测，大大提高检测灵敏度，并有效克服了在254 nm处的梯度洗脱时造成的基线漂移，提高了定量准确性.

林壮森等介绍了采用分光光度法检测饮料中柠檬黄和日落黄的方法[15-16]，通过测定饮料在426 mm和482 nm波长处的吸光度，与柠檬黄和日落黄标准溶液比较，计算样品中柠檬黄和日落黄的含量.

Medeiros等采用掺硼金刚石电极结合流动注射分析，实现了对饮料和明胶样品中4种合成色素(柠檬黄、日落黄、亮蓝和SY)的同时检测[17].

2 液相色谱法测定三种色素含量的实验原理

日落黄、柠檬黄、胭脂红均具有苯磺酸钠结构，本文选用Cleanert PWAX-SPE混合型弱阴离子交换柱和Cleanert PA聚酰胺小柱，用以吸附不同饮料中的合成着色剂，选用氨化甲醇洗脱，采用Venusil® XBP C185 μm 4.6×150 mm，以0.02 mol/L乙酸铵溶液和色谱纯甲醇为流动相梯度洗脱，最后再经反相色谱分离.根据保留时间进行定性和比较峰面积进行定量.这种方法浓缩时间短，适用于大批量样品的同时检测.

3 实验部分

3.1 实验药品

甲醇(分析纯佛山予华仪器科技有限公司、色谱纯西安天茂化工有限公司)；乙醇、甲酸、柠檬酸、氨水(优级纯佛山予华仪器科技有限公司)；乙酸铵(色谱纯西安天茂化工有限公司)；柠檬黄标准储备液、日落黄标准储备液、胭脂红标准储备液(标准物质500 μg/mL)深圳市时得佳科技有限公司)；超纯水(该实验所用水均为超纯水).

3.2 主要实验仪器

赛默飞高效液相色谱仪(UltiMate3000美国赛默飞世尔热电仪器有限公司)；PH计(PHS-25型北京合悦达科技有限公司)；圆形水浴氮吹仪(CM-36型北京成萌伟业科技有限公司)；多管真空固相萃取仪(5982-9110安捷伦科技(中国)有限公司)；固相萃取柱(Cleanert PWAX杭州赛析科技有限公司)；溶剂过滤器(AL-01北京同德创业科技有限公司)

3.3 实验条件

实验所需条件如下所示：

家长不了解学生在校的心理情况，学校通常在学生发生了一些重大的意外情况，如学生突发心理危机事件、严重人际冲突、学籍异动、严重违反校规校纪乃至触犯法律等，为了解决危机，事后才通知家长[2]。家长的参与具有被动性和临时性。

色谱柱：Venusil® XBP C185 μm 4.6×150 mm；流速：1.0 mL /min；进样量：20 μL；波长：254 nm；柱温：35 ℃.

3.4 实验步骤

3.4.1 样品提取 用分析天平分别称取市售10 g(精确至0.000 1g)茶类饮料(康师傅冰红茶、和其正)、果蔬汁类饮料(统一鲜橙多、农夫果园30%混合果蔬)、碳酸饮料(芬达、美年达)、功能饮料(东鹏特饮、乐虎)放入100 mL烧杯中，含二氧化碳的样品(芬达、美年达)先加热以除去二氧化碳.

3.4.2 标准系列溶液的配制 配制不同浓度的日落黄、柠檬黄、胭脂红标准系列溶液.

3.4.3 固相萃取柱净化 Cleanert PWAX-SPE在全自动固相萃取仪中，依次向Cleanert PWAX-SPE小柱中加入6 mL甲醇，6 mL pH=6的水，完成SPE小柱的净化过程.将全部提取液转移到柱子中，然后再用6 mL水 (pH=4)、6 mL甲醇-甲酸溶液(6∶4) 和6 mL水 (pH=6) 淋洗；然后通入空气约5 min吹干小柱，最后用6 mL 2% 氨化甲醇洗脱并接收洗脱液，将洗脱液置于圆形水浴氮吹仪中，在50 ℃水浴中用氮气吹干，用1 mL超纯水溶解并定容，经0.45 μm水系滤器过滤到样品瓶中，供HPLC待测.

3.4.4 测定 取相同体积的样品溶液和标准系列溶液分别置于高效液相色谱仪中按照3.3所示的实验条件进行测定，根据保留时间定性，外标峰面积定量.

4 结果与讨论

4.1 溶液标准曲线的绘制

按照3.3所示的实验条件，将日落黄、柠檬黄、胭脂红标准系列工作溶液注人液相色谱仪中，测定相应的峰面积，得到日落黄标准系列浓度与峰面积的关系，黄标准曲线，如图4、5、6所示.

图4 日落黄标准曲线图Fig.4 Standard curve of sunset yellow图5 柠檬黄标准曲线图Fig.5 Standard curve of lemon yellow图6 胭脂红标准曲线图Fig.6 Standard curve of carmine red

4.2 各合成色素测定的标准曲线方程和相关系数

根据3.3设定的实验条件测得日落黄、柠檬黄、胭脂红在设定浓度范围内，具有线性关系良好的标准曲线，日落黄、柠檬黄、胭脂红标准曲线的回归方程和相关系数见表2.

4.3 三种合成色素标准溶液色谱图

图7 日落黄、柠檬黄、胭脂红混合标准溶液色谱图Fig.7 Chromatogram of mixed standard solution of sunset yellow, tartrazine, and carmine

4.4 样品中三种合成色素的测定与结果

4.4.1 样品中日落黄的测定与结果 取3.5.3处理好的样品液，在波长为254 nm处测定其的峰面积，平行测定三次，取平均值.结果如表5所示：

表5 饮料中日落黄的含量表Tab.5 Content table of sunset yellow in beverage

由表5可知，不同类饮料中，果蔬汁类饮料(统一鲜橙多、农夫果园30%混合果蔬)中日落黄含量较茶类饮料(康师傅冰红茶、和其正)、碳酸饮料(芬达、美年达)和功能饮料(东鹏特饮、乐虎)的高，但均远小于《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)中规定的最大使用量.

4.4.2 样品中柠檬黄的测定与结果 取3.5.3处理好的样品液，在波长为254 nm处测定其的峰面积，平行测定三次，取平均值.结果如表6所示：

表6 饮料中柠檬黄的含量表Tab.6 Content table of tartrazine in beverage

由表6可知，不同类饮料中，果蔬汁类饮料(统一鲜橙多、农夫果园30%混合果蔬)中柠檬黄含量比茶类饮料(康师傅冰红茶、和其正)、碳酸饮料(芬达、美年达)和功能饮料(东鹏特饮、乐虎)的高，但均远小于《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)中规定的最大使用量.

4.4.3 样品中胭脂红的测定与结果 取3.5.3处理好的样品液，在波长为254 nm处测定其的峰面积，平行测定三次，取平均值.结果如表7所示：

表7 饮料中胭脂红的含量表Tab.7 Content table of carmine in beverage

由表7可知，不同类饮料中，果蔬汁类饮料(统一鲜橙多、农夫果园30%混合果蔬)中柠檬黄含量比茶类饮料(康师傅冰红茶、和其正)、碳酸饮料(芬达、美年达)和功能饮料(东鹏特饮、乐虎)的高，但均远小于《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760-1996)中规定的最大使用量.

4.4.4 日落黄、柠檬黄、胭脂红的加标回收率和精密度测定 为了验证该方法的可靠性，进行了加标回收实验.准确称取不含日落黄、柠檬黄、胭脂红的不同类饮料10 g (精确至0.0001 g)，分别加入浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0 μg/mL的混合标准溶液做加标回收实验，每个加标水平平行测定7次，以此来验证该方法的回收率和精密度，其结果如表8所示：

表8 加标回收率和精密度测定结果表(n=7)Tab.8 Results of standard recovery rate and precision measuring (n=7)

由表8可知日落黄、柠檬黄、胭脂红的平均加标回收率为82.8%～102.36%,相对标准偏差为0.65%～1.32%.

5 结论

本文选用Cleanert PWAX-SPE 混合型弱阴离子交换柱和Cleanert PA聚酰胺小柱，用以吸附不同饮料中的合成着色剂，选用氨化甲醇洗脱，采用Venusil® XBP C18 5 μm 4.6×150 mm，以0.02 mol/L乙酸铵溶液和色谱纯甲醇为流动相梯度洗脱，最后再经反相色谱分离.根据保留时间定性和比较峰面积进行定量得出：在市售常见的几类饮料中，果蔬汁类中日落黄、柠檬黄、胭脂红的含量较另外种类饮料的含量要高.其中茶类饮料中，康师傅冰红茶的日落黄含量为0.002 7 g/kg、柠檬黄含量为0.002 9 g/kg、胭脂红含量为0.002 9 g/kg；和其正的日落黄、柠檬黄、胭脂红含量均为未检出.果蔬汁类饮料中，鲜橙多的日落黄含量为0.003 2 g/kg、柠檬黄含量为0.002 5 g/kg、胭脂红含量为0.001 1 g/kg；农夫果园30%混合果蔬的日落黄含量为0.003 5 g/kg、柠檬黄含量为0.003 2 g/kg、胭脂红含量为0.003 0 g/kg.碳酸饮料中，芬达的日落黄含量为0.001 1 g/kg、柠檬黄含量为0.000 5 g/kg、胭脂红含量未检出；美年达的日落黄含量为0.000 2 g/kg、柠檬黄含量为0.000 2 g/kg、胭脂红含量未检出.功能饮料中，东鹏特饮和乐虎三种合成色素含量均为未检出.

由实验数据可知，果蔬汁类饮料中合成色素较其他三类饮料相比含量最多，其中农夫果园30% 混合果蔬的三种合成色素都是最高的.而在日落黄、柠檬黄、胭脂红这三种合成色素种，日落黄、柠檬黄含量相对较高，胭脂红含量最少.同时在这几类饮料中，日落黄、柠檬黄、胭脂红的含量都远小于其检出限和中国《食品添加剂使用卫生标准》中规定的最大使用量，说明这些饮料的色素添加要求都是符合中国《食品添加剂使用卫生标准》的.