栀子苷对溃疡性结肠炎模型大鼠的抗炎作用及AMPK/MLCK 信号通路的影响

莫霏霏 周晶晶 金玲玲 余 光

溃疡性结肠炎是一种结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，临床症状表现为腹泻、腹痛、便秘、腹胀[1-2]。溃疡性结肠炎与促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）等失衡有关[3-4]。传统药物，如5-氨基水杨酸盐（5-ASA）、皮质类固醇、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤用于治疗溃疡性结肠炎，然而其潜在的副作用和有限的疗效限制了这些药物的临床应用[5]。栀子苷是从茜草科植物栀子的干燥成熟果实中运用高科技生产工艺提取精制而成的产品，为环烯醚萜苷类化合物[6-7]。栀子苷广泛用于治疗多种疾病，具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化、免疫调节作用、抗凋亡、和神经保护作用[8]。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）/肌球蛋白轻链激酶（MLCK）是炎症调节通路，MLCK 磷酸化易位至细胞核，与DNA 结合并激活多种重要的炎症靶基因，如白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、白细胞介素-12（IL-12）、TNF-α、一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）[9]。本研究拟探讨栀子苷对溃疡性结肠炎模型大鼠的抗炎作用及AMPK/MLCK 信号通路的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 动物体质量180～220g 的Sprague-Dawley（SD）大鼠90 只购自贵州医科大学实验动物中心，8～10 周龄，雌雄各半，动物生产许可证号：SCXK（黔）2018-0003，动物使用许可证号：SYXK（黔）2018-0021，动物质量合格证号GK304957。环境温度（22±2）℃，保持12:12h 光-暗循环，自由进食饮水，大鼠适应性饲养1 周。本研究经浙江省台州市立医院伦理委员会审核批准（伦理审批号：2020041701）。

1.2 药品与试剂 栀子苷（原料药，纯度98%，西安青芷生物技术有限公司，批号QS006756）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（南京信帆生物技术有限公司，批号P2297）；柳氮磺胺吡啶（上海福达制药有限公司，规格：0.25g/片，批号20190624）；TRIzol 试剂、SuperScriptⅢ逆转录酶（美国Invitrogen 公司，批号15596018、18080844）；荧光定量PCR 试剂盒（QuantiTect SYBR Green 试剂盒）（美国Qiagen 公司，批号218073）；PRO-PREP 蛋白质提取缓冲液、PVDF 膜（碧云天生物技术研究所，批号SF0020-10、FFN05）；蛋白浓度测定试剂盒（美国Bio-Rad 公司，批号PF10552）；LaemmLi 样品缓冲液（迪申生物技术上海有限公司，批号B1610737）；SDS-聚丙烯酰胺凝胶（美国赛默飞世尔公司，批号KG-60559）；AMPK、MLCK、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗（艾美捷科技有限公司，批号A-ABV10093、A-ABV12699、D0063）；兔抗大鼠IgG 二抗（上海群己生物科技有限公司，批号PAB9434）；增强化学发光试剂盒（上海康朗生物科技有限公司，批号KL-F253）；IL-2、IL-6、TNF-α 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定试剂盒（美国Sigma-Aldrich 公司，批号214-838-02、214-838-06、K-024-09）。

1.3 仪器DM3000 型光学显微镜（德国徕卡公司）；CFX96 型实时荧光定量PCR 仪（美国BIO-RAD公司）；AlphaImager HP 型凝胶成像分析系统（自然基因北京科技有限公司）；MK3 型酶标仪（美国热电公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模及给药 采用随机数字表法将大鼠分成五组：对照组、模型组、柳氮磺胺吡啶组（300mg/kg）[10]、栀子苷低、高剂量组[11]（40、80mg/kg），每组18 只。模型组、柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组用TNBS 诱导溃疡性结肠炎。具体操作如下：大鼠禁食过夜并用乙醚轻度麻醉，将5mg TNBS 溶于0.2mL 50%乙醇中，然后使用16 号灌洗针将混合溶液缓慢注入结肠中[12]。对照组大鼠仅用0.2mL 的50%乙醇处理。24h 后，柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组给予相应药物灌胃，灌胃体积10mL/kg，对照组及模型组给予等体积（10mL/kg）的生理盐水，每天1 次，持续4 周。

2.2 各组大鼠结肠黏膜损伤指数、疾病活动指数（DAI）、大体形态损伤评分测定 试验结束后，颈椎脱臼处死大鼠，钝性分离结肠组织，测量长度和重量，4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋。制备结肠样品，苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下根据结肠形态学评估结肠病理损伤。结肠黏膜损伤指数、DAI评分、大体形态损伤评分[13-14]：（1）结肠黏膜损伤指数：大溃疡（≥3mm）计2 分，小溃疡（＜3mm）计1 分，无溃疡计0 分；重度炎症计2 分，轻度炎症计1 分，无炎症计0 分。（2）DAI：其中大鼠体质量下降≥15%、大便性状稀便、肉眼血便计4 分；10%≤体质量下降＜15%、大便性状半稀便、隐血阳性计3 分；5%≤体质量下降＜10%、大便性状半稀便、隐血阳性计2分；；1%≤体质量下降＜5%、大便性状正常、隐血阴性计1 分；0≤体质量下降＜1%、大便性状正常、隐血阴性计0 分。（3）大体形态损伤评分：病变深达浆膜层计3 分，累及黏膜肌层计2 分，累及黏膜下层计1分，局限于黏膜层以上计0 分。

2.3 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK mRNA 水平测定 使用TRIzol 试剂从结肠组织分离总RNA，使用SuperScript Ⅲ逆转录酶进行逆转录。实时聚合酶链反应（PCR）测定结肠组织中AMPK、MLCK mRNA水平。用于PCR 分析的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：AMPK 正向5'-AAGGTGTCTAGCCTGGAGACCTGGTGATC-3' 和反向5'-CCTGTGACGTGAATCCCTGACTTGAGTGC-3'；MLCK 正向5'-CCTGACGTCTGGAGATCGAGGT-3'和反向 5' -CCTGTGACTATCAAATTGCGGT -3'；GAPDH 正向5'-ACAAGATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3' 和反向5'-AGCTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3'。GAPDH 为内参基因。使用QuantiTect SYBR Green 试剂盒在CFX96 型实时荧光定量PCR 仪中进行PCR，总反应体积为20μL。反应条件：在95℃下初始变性步骤10min，在95℃下变性15s，在57℃下退火20s，在72℃下延伸1min，进行40 个循环。采用2-ΔΔCT 法计算AMPK、MLCK mRNA 的相对表达量。

2.4 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK 蛋白水平测定 在PRO-PREP 蛋白质提取缓冲液中裂解制备结肠组织提取物，用蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白质浓度，将蛋白质与LaemmLi 样品缓冲液混合并在加载前在100℃下加热5min。总蛋白质样品（30μg）在100～120V 下进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳90min，分离的蛋白质在100V 电泳转移至PVDF 膜，在5%脱脂牛奶中室温下封闭1h，然后以1:1000 的稀释度与AMPK、MLCK、GAPDH 一抗孵育过夜。磷酸缓冲盐溶液（PBS）中洗涤，室温下加入兔抗大鼠IgG 二抗（1:2000 稀释）孵育1h。采用增强化学发光试剂盒检测表达强度。通过AlphaImager 软件测量和分析蛋白质印迹上每个条带的相对强度，从光密度测量值中减去胶片中的背景，重复实验3 遍，对获得的相对强度值进行统计分析，图中显示的凝胶代表3个独立实验的结果。

2.5 各组大鼠结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平测定 获取病变结肠组织，眼科剪剪碎，加生理盐水匀浆，以7000r/min 离心15min，分离上清，置于4℃保存待测；使用ELISA 试剂盒测定大鼠结肠组织中IL-2、IL-6、TNF-α 水平，具体操作方法参照试剂盒说明书。

2.6 统计学方法 应用SPSS 23.0 统计软件对数据进行录入、统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q 检验；P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分比较 与对照组比较，模型组结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分升高（P<0.05）；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分降低（P<0.05），且栀子苷高剂量组结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分低于栀子苷低剂量组（P<0.05）；与柳氮磺胺吡啶组比较，栀子苷低剂量组结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分升高（P<0.05），栀子苷高剂量组结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分无明显变化（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分比较（分，）

表1 各组大鼠结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分比较（分，）

注：对照组和模型组予10mL/kg 生理盐水灌胃；柳氮磺胺吡啶组予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；栀子苷低剂量组予40mg/kg 栀子苷灌胃；栀子苷高剂量组予80mg/kg 栀子苷灌胃；DAI 为疾病活动指数；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与柳氮磺胺吡啶组比较，cP<0.05；与栀子苷低剂量组比较，dP<0.05

3.2 各组大鼠结肠组织病理结构比较 对照组结肠组织中未观察到损伤，结肠结构正常；模型组肠黏膜充血，肠黏膜上皮细胞脱落，显示炎性细胞浸润到黏膜，杯状细胞和上皮的脱落，隐窝结构变形，可见明显中性粒细胞浸润；柳氮磺胺吡啶组及栀子苷高剂量组结肠结构趋于正常，肠黏膜充血、肠黏膜上皮细胞脱落减轻，炎症细胞浸润减少，显示隐窝结构，杯状细胞和上皮细胞逐渐恢复；栀子苷低剂量组较模型组结肠结构好转，但仍可见明显充血及炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理结构图（苏木精-伊红染色×200）

3.3 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK mRNA 表达水平比较 与对照组比较，模型组结肠组织AMPK mRNA 表达水平降低（P<0.05），MLCK mRNA 表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组结肠组织AMPK mRNA 表达水平升高（P<0.05），MLCK mRNA 表达水平降低（P<0.05），且栀子苷高剂量组结肠组织AMPK mRNA 表达水平高于栀子苷低剂量组（P<0.05），MLCK mRNA 表达水平低于栀子苷低剂量组（P<0.05）；与柳氮磺胺吡啶组比较，栀子苷低剂量组结肠组织AMPK mRNA 表达水平降低（P<0.05），MLCK mRNA表达水平升高（P<0.05），栀子苷高剂量组结肠组织AMPK、MLCK mRNA 表达水平无明显变化（P>0.05）。见表2。

表2 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK mRNA 表达水平比较（）

表2 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK mRNA 表达水平比较（）

注：对照组和模型组予10mL/kg 的生理盐水灌胃；柳氮磺胺吡啶组予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；栀子苷低剂量组予40mg/kg 栀子苷灌胃；栀子苷高剂量组予80mg/kg 栀子苷灌胃；AMPK 为腺苷酸激活蛋白激酶；MLCK 为肌球蛋白轻链激酶；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与柳氮磺胺吡啶组比较，cP<0.05；与栀子苷低剂量组比较，dP<0.05

3.4 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK 蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组结肠组织AMPK 蛋白表达水平降低（P<0.05），MLCK 蛋白表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组结肠组织AMPK 蛋白表达水平升高（P<0.05），MLCK 蛋白表达水平降低（P<0.05），且栀子苷高剂量组结肠组织AMPK 蛋白表达水平高于栀子苷低剂量组（P<0.05），MLCK 蛋白表达水平低于栀子苷低剂量组（P<0.05）；与柳氮磺胺吡啶组比较，栀子苷低剂量组结肠组织AMPK 蛋白表达水平降低（P<0.05），MLCK 蛋白表达水平升高（P<0.05），栀子苷高剂量组结肠组织AMPK、MLCK 蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。见表3、图2。

表3 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK 蛋白表达水平比较（）

表3 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK 蛋白表达水平比较（）

注：对照组和模型组予10mL/kg 的生理盐水灌胃；柳氮磺胺吡啶组予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；栀子苷低剂量组予40mg/kg 栀子苷灌胃；栀子苷高剂量组予80mg/kg 栀子苷灌胃；AMPK 为腺苷酸激活蛋白激酶；MLCK 为肌球蛋白轻链激酶；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与柳氮磺胺吡啶组比较，cP<0.05；与栀子苷低剂量组比较，dP<0.05

图2 各组大鼠结肠组织AMPK、MLCK 蛋白印迹图

3.5 栀子苷对大鼠结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影响 与对照组比较，模型组结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05）；与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平降低（P<0.05），且栀子苷高剂量组结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于栀子苷低剂量组（P<0.05）；与柳氮磺胺吡啶组比较，栀子苷低剂量组结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平升高（P<0.05），栀子苷高剂量组IL-2、IL-6、TNF-α 水平无明显变化（P>0.05）。见表4。

表4 栀子苷对大鼠结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影响（ng/g，）

表4 栀子苷对大鼠结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平的影响（ng/g，）

注：对照组和模型组予10mL/kg 的生理盐水灌胃；柳氮磺胺吡啶组予300mg/kg 柳氮磺胺吡啶灌胃；栀子苷低剂量组予40mg/kg 栀子苷灌胃；栀子苷高剂量组予80mg/kg 栀子苷灌胃；IL-2 为白细胞介素-2；IL-6 为白细胞介素-6；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与柳氮磺胺吡啶组比较，cP<0.05；与栀子苷低剂量组比较，dP<0.05

4 讨论

栀子苷来自传统中药栀子果实，具有止泻、保肝、抗炎和抗内毒素活性的作用[15-16]。据报道，栀子苷通过抑制炎症反应和肾细胞凋亡治疗急性肾损伤；通过抑制炎症和改善细胞凋亡治疗阿尔茨海默病；通过抑制核因子-κB 对动物心脏具有保护作用[17]。本研究旨在探讨栀子苷在溃疡性结肠炎模型大鼠肠道炎症防护和改善中的作用及其机制。本次研究结果显示，柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分低于模型组，且栀子苷高剂量组结肠黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分低于栀子苷低剂量组（P<0.05）。黏膜损伤指数、DAI 评分、大体形态损伤评分为肠道损伤的具体指标，其水平越高说明损伤越严重[18]；本研究结果表明，栀子苷能抑制溃疡性结肠炎大鼠肠道损伤。结合病理结果，柳氮磺胺吡啶组及栀子苷高剂量组结肠结构趋于正常，肠黏膜充血、肠黏膜上皮细胞脱落减轻，炎症细胞浸润减少，显示隐窝结构，杯状细胞和上皮细胞逐渐恢复；栀子苷低剂量组较模型组结肠结构好转，但仍可见明显充血及炎症细胞浸润，这说明栀子苷明显抑制溃疡性结肠炎大鼠肠道炎症反应。

肠上皮屏障功能的维持和破坏与肠道炎症有关，AMPK 活性在上皮屏障功能中具有特定的作用[19]。脂多糖（LPS）诱导的肠道内皮通透性过高与AMPK 活性降低同时发生，5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1呋喃半乳糖（一种有效的AMPK 激活剂）对AMPK的激活减弱了LPS 诱导的体外内皮通透性[20]。增加的MLCK 蛋白表达和减少的闭锁蛋白（occludin）/闭锁小带蛋白-1（ZO-1）表达被发现诱导肠屏障功能的破坏[21]。炎症是针对有害和感染因子的宿主防御反应的结果，涉及许多疾病的病理生理学[22]。炎性刺激通过IkBa 的降解磷酸化引起MLCK 信号传导的激活，Phospho-MLCK 易位到细胞核中并与DNA 结合，从而作为不同促炎调节因子的转录因子，如IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α、iNOS 和COX-2[23]，因此，抑制MLCK 信号传导将是减轻炎症的治疗方法之一[24]。本研究结果显示，柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低剂量组、栀子苷高剂量组结肠组织AMPK mRNA 和蛋白表达高于模型组，MLCK mRNA 和蛋白表达低于模型组，且栀子苷高剂量组结肠组织AMPK mRNA 和蛋白表达高于栀子苷低剂量组，MLCK mRNA 和蛋白表达低于栀子苷低剂量组。认为栀子苷增强AMPK mRNA 和蛋白表达，抑制MLCK mRNA 和蛋白表达。同时本研究也发现，模型组结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平高于对照组（P<0.05），柳氮磺胺吡啶组、栀子苷低、高剂量组结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于模型组，且栀子苷高剂量组结肠组织IL-2、IL-6、TNF-α 水平低于栀子苷低剂量组（P<0.05），表明栀子苷可能通过AMPK/MLCK 通路抑制炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α 表达水平。

综上所述，栀子苷能抑制溃疡性结肠炎大鼠肠道损伤及炎症反应；其机制可能与增强结肠组织AMPK mRNA 和蛋白表达，抑制MLCK mRNA 和蛋白表达，进而抑制AMPK/MLCK 信号通路有关。