榴莲核黄酮的提取及其对秀丽隐杆线虫 氧化和衰老的影响

王 凤，肖楚翔，刘淑珍，王凤舞*

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266109）

人口老龄化已成为全球最为关注的热点问题之一，有报道称预计再过30 年全球将会迎来21亿老年人口，因此“衰老”和“抗衰老”成为多数领域的研究热点[1]。 β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）是老年斑的重要组分，其过度产生和聚集会诱使氧化稳态失衡，产生大量的自由基和过氧化物，使得机体表现出氧化和衰老症状。天然产物可从调控衰老基因、抗氧化、减少蛋白质沉积等方面抗衰老及治疗衰老相关疾病[2]，如有学者确定了半枝莲的黄酮类物质可上调抗氧化基因mRNA表达水平，从而达到抗衰老的效果[3]；有学者确定了地黄花通过提高体内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性来加强抗氧化作用，从而延缓衰老[4]；还有学者确定了六味地黄丸乙醇提取物能够通过减少Aβ沉积缓解氧化、延缓衰老[5]等。

榴莲风味独特，被称为“南洋水果之王”，其具有很高的营养价值，经常食用可以强身健体、健脾补气、补肾壮阳、活血散寒[6]。目前对榴莲的研究主要集中在果肉和果壳上，已有研究者在榴莲果壳中提取得到了总黄酮[7-9]。黄酮类化合物种类和数量众多，其中黄酮和黄酮醇最为常见，含量最多的槲皮素对氧化衰老具有较强的生物活性。目前对榴莲核的研究鲜见报道，本实验对榴莲核进行了黄酮类物质的提取和延缓衰老效果的初探，以期对榴莲的全面开发和药用价值的利用提供参考。

秀丽隐杆线虫又称秀丽线虫，是一种身体通透、非寄生、全长约1 mm、结构简单、繁殖力强、以细菌为食且培养成本低的模式生物[10]；其生命周期短，卵在常温下发育为成虫只需3～4 d[11]；其生命力强，逆境条件下可进入Dauer状态，待外界条件满足生存需求时便可直接从Dauer期进入到L4期；其遗传背景清晰，是第一个被阐明全部基因组序列的真核多细胞生物[12]；且已被鉴定出有60%～80%的基因同人类基因同源[13-14]。由于秀丽隐杆线虫具有以上多种优势，其作为模式生物已被广泛应用于人类复杂疾病的研究并发展成为药物开发的工具。

本实验通过研究最佳提取工艺条件下榴莲核黄酮提取物的体外抗氧化性以及体内对秀丽隐杆线虫的影响，探讨榴莲核黄酮抗氧化衰老的作用效果，以期为活性物质的筛选研究提供依据，也为榴莲的全面认识和综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

榴莲购于青岛城区大润发超市，取榴莲核备用；芦丁标准品、抗坏血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉 英国OXOID公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 天津市巴斯夫化工有限公司；胆固醇、硫酸镁、氯化钙 天津市北联精细化学品开发公司；秀丽隐杆线虫株系CL4176和大肠杆菌株系OP50（尿嘧啶渗漏突变株） 美国明尼苏达大学线虫遗传中心。

1.2 仪器与设备

FD-1D-80冷冻干燥机 美国SIM公司；KQ-500TDE型高频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TGL-16M 高速台式冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司； WFZUV-2000分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；DHP-9032型电热恒温培养箱 龙口市先科仪器 公司；生物显微镜 日本Olympus株式会社。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

榴莲核洗净，沥干，切片后冷冻干燥3 d，研磨，过60 目筛，4 ℃保存备用。

1.3.2 榴莲核中总黄酮的提取

准确称取0.1 g榴莲核粉末，加入20 mL体积分数40%乙醇溶液和0.5 g硫酸铵形成双水相[15-17]，浸泡30 min后在350 W功率下超声70 min，然后6000 r/min离心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中用乙醇溶液定容，备用。

1.3.3 榴莲核中总黄酮提取率的测定

准确量取待测液10 mL于25 mL比色管中，加入质量分数5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀后静置6 min；加入质量分数10%硝酸铝溶液1 mL，混匀后静置6 min；加入质量分数4%氢氧化钠溶液10 mL，然后用体积分数70%乙醇溶液定容到25 mL，混匀后静置15 min；采用紫外分光光度法测定其510 nm波长处的吸光度[18-19]。

以芦丁标准品作标准曲线，根据标准曲线回归方程（Y＝0.0118X-0.0034，决定系数R2＝0.999，其中Y代表吸光度，X代表芦丁标准液质量浓度/（µg/mL）） 可以得出样品提取液中的芦丁含量，按照下列公式计算出待测液中总黄酮的提取率。

式中：ρ为将总黄酮提取液所测得的吸光度代入标准曲线回归方程所对应的总黄酮质量浓度/（mg/mL）；V为测定总黄酮含量时的取样体积/mL；V1为总黄酮提取液的体积/mL；V2为测定总黄酮含量时的定容体积/mL；m为样品的质量/g。

1.3.4 单因素试验

分别准确称取0.1 g样品于6 支锥形瓶中，分别加入体积分数40%乙醇溶液5、10、15、20、25、30 mL，参照1.3.2节方法，考察料液比对榴莲核总黄酮提取率的影响。并参照上述步骤，考察超声时间（40、50、60、70、80、90 min）、超声功率（250、300、350、400、450 W）、硫酸铵用量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g）以及乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%、80 %）对榴莲核总黄酮提取率的影响。

1.3.5 正交试验优化

在单因素试验的基础上，选取乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率进行4因素3水平的正交优化试验得出最佳提取工艺条件[20]，试验因素及水平见表1。

表 1 L9（34）正交试验因素水平Table 1 Code and level of independent variables used for L9 (34) orthogonal array design

1.3.6 体外抗氧化活性的测定

采用分光光度法、邻二氮菲-Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化法分别测定榴莲核黄酮提取物对DPPH自由基、羟自由基以及超氧阴离子自由基的清除能力，具体测定方法分别参考文献[21-23]。

1.3.7 线虫培养和同期化

线虫的培养使用线虫生长培养基（nematode growth medium，NGM），其上涂布有大肠杆菌OP50作为线虫的食物，于16 ℃恒温恒湿培养箱中培养。

1.3.8 线虫寿命的测定

寿命的测定主要是用来判断黄酮提取物在抗氧化的同时是否会延长或缩短线虫的寿命。将产卵期的秀丽隐杆线虫挑至涂有黄酮提取物的培养基上进行产卵同期化，待线虫孵化生长至L4期后升温至23 ℃，升温培养可加速线虫衰老，缩短生命周期，28 h后开始观察秀丽隐杆线虫的存活状态，通过更换培养基的方式每天计数死亡、丢失和存活线虫的条数，直至空白组和样品组的线虫死亡完全[25-26]。

1.3.9 运动能力测定

本实验将线虫头部摆动次数作为秀丽隐杆线虫运动能力的衡量标准，以此判断黄酮提取物在抗氧化的同时，是否会对线虫的运动能力造成影响。将产卵期的秀丽隐杆线虫挑至涂有黄酮提取物的培养基上进行产卵同期化，待线虫孵化生长至L4期后升温至23 ℃，28 h后将秀丽隐杆线虫挑取至未涂大肠杆菌OP50的空白NGM培养基上，使其在爬行过程中除掉虫身黏附的菌，再将线虫转移至另一空白培养基，记录1 min内线虫头部摆动的次数，每天记录运动次数，直至运动能力丧失[27]。将线虫头部从一侧摆回另一侧，再摆动回来定义为一次头部摆动。每组至少测定20 条秀丽隐杆线虫。

1.3.10 生殖能力测定

本实验生殖能力的测定主要是通过判断黄酮提取物对线虫子代数目的影响从而来评判样品在抗氧化的同时是否会对秀丽隐杆线虫的子代产生抑制作用。具体处理方法同1.3.8节线虫寿命测定。每组挑取2 条线虫单独饲养，每天观察线虫产卵情况，产第一颗卵的时间记为生殖能力实验第1天。每24 h将线虫转至新板，直至生殖能力丧失。16 ℃下孵育产卵板，48 h后计数子代数目。

1.3.11 瘫痪缓解实验

翻译要求分析：校园宣传语具有启发教育性、艺术审美性等特点，校园宣传语语体也有其自身的语体风格和修辞艺术。以简明优美的语言打动人，以新颖形象的创意吸引人，以真挚生动的情感感染人。翻译过程中，译者如果只是考虑译文要忠实于源文，而忽略受众、语体、修辞手法等因素，译文有可能无法满足这些要求，翻译往往缺乏充分性。

将产卵期的秀丽隐杆线虫挑至涂有黄酮提取物的培养基上进行产卵同期化，待线虫孵化生长至L4期后升温至23 ℃，28 h后开始观察秀丽隐杆线虫是否瘫痪，每2 h计数一次瘫痪条数，直至全部瘫痪[28-30]。瘫痪的判断依据：线虫状态活跃，可正常运动计为正常；机械性刺激线虫尾部不再做曲线运动，身体不能移动，仅做头部摆动计为瘫痪。培养28 h后用1 mL的M9缓冲液将平板上的线虫冲洗并收集至EP管中，4200 r/min离心2 min，弃上清液，并加入150 µL含有体积分数4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（10 mmol/L pH 7.4），于4 ℃固定24 h后用预冷的磷酸盐缓冲液反复冲洗，加入150 µL含有体积分数5%β-巯基乙醇、体积分数1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的125 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl， 于37 ℃孵育24 h后漂洗，用0.125%硫黄素T-50%乙醇染色2 min，再用体积分数50%乙醇溶液脱色制片后便可在荧光显微镜下对Aβ沉积情况进行观察分析。

1.3.12 体内抗氧化酶活力测定

将同期化并升温处理后的线虫用M9缓冲液冲洗并收集至EP管中，1000r/min离心10 min，弃上清液，然后用磷酸盐缓冲液重悬，冰上匀浆，最终制成体积分数5%线虫匀浆。按照南京建成生物工程研究所试剂盒的说明书对秀丽隐杆线虫匀浆液中SOD活力、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量进行测定。

1.4 数据统计与分析

采用GraphPad Prism 5软件对实验数据进行处理分析并作图，采用t检验分析数据间的差异显著性。实验均重复3 次，以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验分析结果

通过图1A可以看出，榴莲核总黄酮的提取率随料液比的增加而增加，但到达一定的比值时，提取率趋于平稳。可能的原因是，榴莲核中总黄酮的溶出率随溶剂的增加而增大，当溶剂达到一定量时，总黄酮全部溶出，含量达到最大。通过图1B可以看出，榴莲核总黄酮的提取率随超声时间的延长而增加，但超过一定的时间，提取率随时间的延长反而下降。原因可能是延长超声时间可提高榴莲核中总黄酮的析出，但当超声时间过长时，溶出的总黄酮发生分解从而提取率下降。通过图1C可以看出，榴莲核总黄酮的提取率随超声功率的增加而逐渐增加，但超过一定的超声功率其提取率反而下降。这可能是由于超声对植物细胞有很好的破碎功能，随着功率的增加，加大了榴莲核细胞的破碎程度，所以增加了总黄酮的溶出量。但是当超声功率过大时，又会造成总黄酮的分解或氧化，从而造成提取率下降。通过图1D可以看出，榴莲核总黄酮的溶出量随着硫酸铵用量的增加而增加，当硫酸铵达到一定用量时，其提取率趋于平稳。这可能是因为硫酸铵起到的作用是与乙醇构成双水相体系，对提取榴莲核中总黄酮起到协同作用。通过图1E可以看出，榴莲核总黄酮随乙醇体积分数的增加而增加，但当乙醇超过一定体积分数时，其提取率反而下降。这可能是由于乙醇体积分数的增加使得溶剂极性增强，有利于总黄酮的超声提取，从而提高了总黄酮的提取率。但当乙醇体积分数过大时，榴莲核中一些脂溶性物质的溶出量也会随之增加，反而抑制了总黄酮的溶出。综上，单因素试验中最佳料液比、超声时间、超声功率、硫酸铵用量和乙醇体积分数分别为1∶200、70 min、350 W、0.5 g以及40%。

图 1 各因素对榴莲核总黄酮提取率的影响Fig. 1 Effect of various factors on the extraction rate of total flavonoids from durian seeds

2.2 正交试验分析结果

由表2可知，不同的工艺条件对榴莲核总黄酮的提取率存在一定的差异，其中最高提取率是最低提取率的1.33 倍。通过极差分析可以得知，各因素对榴莲核 总黄酮提取率的影响大小顺序为超声功率＞乙醇体积分数＞超声时间＞料液比，榴莲核总黄酮的最佳提取工艺条件为A2B1C2D3，即乙醇体积分数为40%、料液比为1∶220、超声时间为70 min、超声功率为400 W。在最优条件下进行5 次重复试验，平均提取率为（9.25±0.05）%。表明试验设计合理可行，数据可靠，适合榴莲核中总黄酮的提取。

表 2 L9（34）正交试验结果Table 2 L9 (34) orthogonal array design with experimental results

2.3 榴莲核总黄酮提取物体外抗氧化活性

由表3可知，榴莲核中的总黄酮提取物具有很强的DPPH自由基清除能力（92.6%），相同质量浓度下，效果优于阳性对照VC（73.1%）；具有相对较高的羟自由基清除率（79.4%），相同质量浓度下，效果与阳性对照VC（87.5%）相当；且对超氧阴离子自由基也有一定的清除效果（27.0%）。结果表明榴莲黄酮提取物具有很高的体外抗氧化能力，因此进一步考察其是否具有体内延缓衰老的功效。

表 3 榴莲核总黄酮对自由基的清除率Table 3 Free radical scavenging rates of total flavonoids from durian seeds

2.4 榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫氧化衰老的影响

2.4.1 榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫寿命的影响

秀丽隐杆线虫的平均寿命是14～21 d，由图2可知，升温培养加速了线虫的衰老，缩短了线虫的生长周期。但黄酮提取物样品组与只喂食大肠杆菌OP50空白组线虫的寿命不同，样品能使线虫生存曲线右移，生命周期较空白组延长了约20%，这说明榴莲核黄酮提取物能明显延长线虫的寿命。

图 2 榴莲核黄酮提取物对线虫寿命的影响 Fig. 2 Effect of flavonoids extract from durian seeds on the lifespan of C. elegans

图 3 榴莲核黄酮提取物对线虫运动能力的影响Fig. 3 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the mobility of C. elegans

2.4.2 榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫运动能力的影响由图3可知，两组线虫的运动能力均随着时间的延长而下降，这是因为线虫体内氧化程度超出了自身的清除能力，氧化和抗氧化系统失衡使线虫逐步达到衰老状态，进而使其运动能力被削弱。但是黄酮提取物组秀丽隐杆线虫的头部摆动频率均高于只喂食大肠杆菌OP50空白组，且与空白组相比，样品组随着时间延长呈现出效果逐渐明显的趋势。这说明在一定时间范围内黄酮提取物能够缓解运动能力下降程度，即黄酮提取物在延缓线虫衰老、提高运动能力方面具有重要潜力。

2.4.3 榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响

图 4 榴莲核黄酮提取物对线虫生殖能力的影响Fig. 4 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the fertility of C. elegans

本实验主要是通过每天计数子代数目评判黄酮提取物起抗氧化作用的同时对子代的影响。由图4可知， 线虫产卵期一般持续4 d左右，且第2天为产卵高峰期。只喂食大肠杆菌OP50空白组与喂食黄酮提取物样品组线虫相比，后者在第1天和第2天的产卵量要高于前者，两者无显著差异；在第3天时，空白组和样品组线虫的产卵量均明显下降；在第4天时，两组线虫均完成产卵，总产卵量均为220 个左右，无显著性差异（P＞0.05）。这说明榴莲核黄酮提取物在缓解氧化损伤、延缓衰老的同时并不会对秀丽隐杆线虫的生殖能力造成显著伤害。

2.4.4 榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫瘫痪缓解能力的影响

一方面，升温培养加速了线虫的氧化和衰老且缩短了其生长周期，使实验得以较快、较准确的完成；另一方面，升温可诱导模式生物秀丽隐杆线虫CL4176体内表达Aβ，Aβ为氧化衰老反应的产物，其在体内聚集使得线虫出现瘫痪表型，所以可通过观察瘫痪表型的变化判断榴莲核黄酮提取物能否缓解或抑制Aβ毒性，缓解氧化损伤。由图5可知，在瘫痪缓解能力测定中，通过对线虫瘫痪率的统计发现在第1天时空白组和样品组均未出现瘫痪现象；在第2～5天时，两组均持续瘫痪但喂食榴莲核黄酮提取物组秀丽隐杆线虫的瘫痪率明显低于空白组。由图6可知，黄酮提取物能够明显改善线虫体内Aβ沉积情况。这说明，榴莲核黄酮提取物能够缓解Aβ毒性，降低线虫CL4176瘫痪率。

图 5 榴莲核黄酮提取物对线虫瘫痪缓解能力的影响Fig. 5 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the paralysis relief of C. elegans

图 6 线虫体内Aβ沉积情况Fig. 6 Aβ aggregation in C. elegans

2.4.5 榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫抗氧化酶活力的影响

鉴于榴莲核黄酮提取物能够缓解线虫氧化损伤病症，进一步分析其对秀丽隐杆线虫体内抗氧化酶的影响。 由图7A可知，在线虫体内抗氧化酶活力的测定中，喂食榴莲核黄酮提取物的线虫组具有更高的SOD活力，较空白组线虫而言，样品组显著提高了27.91%（P＜0.05）。由图7B可知，在CAT活力测定中，空白组和样品组线虫的CAT活力分别为163.00 U/g和177.72 U/g，样品组较空白组提高了8.28%。MDA是生物体内脂质氧化产生的一种天然产物，被广泛应用为脂质氧化的指标，由图7C可知，喂食榴莲核黄酮提取物的线虫组具有更低的MDA含量，较空白组线虫的MDA含量而言，样品组极显著降低了30.77%（P＜0.01）。表明榴莲核黄酮提取物在一定程度上能够提高线虫体内抗氧化能力，缓解氧化损伤，缓解线虫衰老。

图 7 榴莲核黄酮提取物对线虫体内SOD活力（A）、CAT活力（B）和MDA含量（C）的影响 Fig. 7 Effect of flavonoid extract from durian seeds on SOD activity (A), catalase activity (B) and MDA content (C) in C. elegans

3 结 论

本实验确定榴莲核黄酮提取物的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数为40%、料液比为1∶220、超声时间为70 min、超声功率为400 W。在最优条件下进行5 次重复试验，榴莲核总黄酮平均提取率可达（9.25±0.05）%。

最优条件下获得的榴莲核黄酮提取物具有一定的体外抗氧化活性，其具有很强的清除DPPH自由基的能力以及较高的羟自由基清除率，对超氧阴离子自由基也有较好的清除效果，清除率分别达到92.6%、79.4%和27.0%。

榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫的氧化损伤和衰老具有一定的保护作用。黄酮提取物样品组与空白组的线虫相比，样品组线虫的生存曲线右移，即黄酮提取物对延缓衰老、延长寿命起到了积极的作用；样品组线虫的运动能力均高于空白组，且随着时间延长样品效果趋于显著，即黄酮提取物在一定程度上能够延缓衰老、提高运动能力；线虫的生殖期为4 d左右，这段时间内两组线虫呈现出不同的产卵量，但两组总产卵量均在220 个左右，即榴莲核黄酮提取物对秀丽隐杆线虫的后代不会产生显著影响，对提取物的功效可进一步的研究与运用；样品组的线虫瘫痪率要低于空白组，表示榴莲核黄酮提取物能够减少Aβ沉积，缓解氧化损伤；而且样品组线虫的体内抗氧化相关酶活力高于空白组，表示榴莲核黄酮提取物具有较好的体内抗氧化效果。

综上，本实验为榴莲核黄酮提取物的抗氧化、抗衰老研究提供参考，同时有助于对榴莲的全面认识和开发。