西式熏煮火腿在不同贮藏温度下细菌多样性 和挥发性风味化合物分析

冉 渺，何腊平*，朱秋劲

（贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳 550025）

西式熏煮火腿由于其良好的感官特性、健康属性和便利性成为深受消费者喜爱的即食肉制品之一[1]。温度是贮藏过程微生物生长繁殖的主要驱动力[2]。零售商店开放式冷藏柜等温度滥用情况使得西式熏煮火腿这类对温度敏感的肉制品在贮藏后期细菌大量繁殖，货架期缩短。温度滥用会影响菌群的组成，导致更为复杂的细菌多样性[3]。高通量测序技术是一种免培养的分子生物学技术，在揭示天然发酵乳制品tarag[4]、不同成熟阶段的传统意大利香肠[5]、不同增菌温度下的冷鲜鸡肉[6]等的细菌多样性方面应用广泛。

熏煮火腿的风味影响消费者购买欲[7]。风味变差是火腿贮藏时最先被发现的品质变质[8]。贮藏温度对于发酵食品具有重要影响。贮藏温度滥用使得酸奶中酵母菌快速生长，导致过多的气体形成和异味产生[9]。Leroy等[10]认为在气调包装熟火腿中检测到的几种挥发性化合物可能是细菌的葡萄糖和氨基酸代谢引起，它们的产生与贮藏温度有关。García等[8]建议利用肠杆菌数量和挥发性化合物含量来确定肉类的初期变质。Martín等[11]发现变质的伊比利亚干腌火腿的微生物显著改变了其挥发性化合物。食品的风味不仅与风味化合物含量有关，还与感觉阈值有关[12]。 相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法是一种确定食品中挥发性风味化合物的方法[13]， ROAV越大对食品中的整体风味贡献越大[14]。Sun Lingxia等[15]通过ROAV法确定了炖鸡的风味成分，结果表明ROAV法是一种可行的选择方法。然而，人们对温度滥用情况下西式熏煮火腿贮藏过程中细菌多样性及与之有关的挥发性风味化合物知之甚少。

本研究首先通过高通量测序法测定了4、10、15、20 ℃和25 ℃这5 个恒定温度模拟温度滥用情况下西式熏煮火腿的细菌群落。同时通过气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法检测在相同过程中的挥发性化合物，并利用ROAV法确定了挥发性风味化合物。然后使用正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）对基于细菌属的挥发性风味化合物进行样品分类。最后，对细菌属与挥发性风味化合物进行相关性分析。本研究为确定西式熏煮火腿不同贮藏温度下的优势菌以及基于细菌形成的挥发性风味化合物提供数据支持和理论支撑，有助于帮助制定新策略以减少因滥用温度导致西式熏煮火腿细菌群落变化或因细菌群落变化引起的挥发性风味变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪后腿肉购自贵州五福坊食品有限公司；烟熏液（C-10-12、C-10-06）购自美国红箭国际公司。

Mag-Bind Soil DNA Kit 美国Omega公司；Qubit 3.0 DNA检测试剂盒 美国Life公司；2×TaqMaster Mix 美国Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物公司。

1.2 仪器与设备

ZBJ-40斩拌机、GR-60间歇式真空滚揉机 诸城市新得利食品机械有限公司；GCJ-50灌肠机 诸城市华刚机械有限公司；SPX-50B生化培养箱 天津赛得利斯实验分析仪器制造厂；Pico-21台式离心机 美国Thermo Fisher公司；GL-88B漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TND03-H-H混匀型干式恒温器 深圳 拓能达科技有限公司；DYY-6C电泳仪、DYCZ-21电 泳槽 北京市六一仪器厂；凝胶成像系统 美国UVP公司；Q32866 Qubit®3.0荧光计 美国Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头 美国Supelco公司；456-GC-SQ GC-MS联用仪 美国赛里安仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 西式熏煮火腿的制作

根据Han Yanqing等[16]的方法稍作修改。首先将选自猪后腿的原料肉去除结缔组织、淋巴、脂肪等，将其切成长宽高为3 cm×2 cm×1 cm的肉块，加入腌制液（食盐2.0%（以肉块质量计，后同），亚硝酸钠0.015%、异抗坏血酸钠0.06%、多磷酸钠0.1%、焦磷酸钠0.2%、白糖0.8%、蒸馏水30%、乳酸链球菌素（Nisin）0.02%）混合均匀后在4 ℃冰箱中放置36 h，然后将腌制好的肉块取少部分斩拌为肉糜，将斩拌好的肉糜、肉块和配料（盐0.4%（以肉糜、肉块总质量计，后同）、味精0.5%、黑胡椒粉0.5%、大豆蛋白2.2%、淀粉6.5%、黄原胶0.2 %、卡拉胶0.3%、红曲红0.01%、烟熏液C-10-120.2%、烟熏液C-10-06 0.5%）在间歇式真空滚揉机中滚揉6 h（工作30 min、间歇10 min），灌肠，最后在80 ℃的恒温水浴锅中煮2 h，冰水冷却，切成薄片，真空包装。

1.3.2 实验分组

将西式熏煮火腿分别放置在4、10、15、20 ℃ 和25 ℃生化培养箱中，根据贮藏实验结果确定了西式熏煮火腿在4、10、15、20 ℃和25 ℃下贮藏时间分别为61、61、37、25、21 d，在4 ℃贮藏前期1 d（EH）、贮藏中期31 d（MH4）、贮藏后期61 d（LH4）和其他温度（10、15、20、25 ℃）的贮藏后期61 d（LH10）、37 d（LH15）、25 d（LH20）、21 d （LH25）这7 个时间点参考Liang Huipeng等[17]的方法均收集3 个样品并充分混匀后进行分析。

1.3.3 细菌菌落的高通量测序

在无菌环境下准确称取25 g剪碎的样品放入225 mL灭菌的生理盐水，振荡混匀，10000 r/min室温离心3 min，弃置上层液体。按照Mag-Bind Soil DNA Kit相应的操作步骤进行细菌总DNA提取并用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果。对细菌16S rDNA的V3～V4进行PCR扩增。1）第一轮扩增体系：2×Taqmaster Mix 15 μL、Bar-PCR Primer F 10 μmol/L 1 μL、Primer R 10 μmol/L 1 μL、Genomic DNA 10～20 ng，加灭菌超纯水至30 μL；条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，进行5 个循环；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，进行20 个循环；72 ℃完全延伸5 min；PCR产物进行琼脂糖电泳检测；2）第二轮扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物，体系：2×Taqmaster Mix 15 μL、Primer F 10 μmol/L 1 μL、Primer R 10 μmol/L 1 μL、上一轮PCR产物20 ng，加灭菌超纯水至30 μL；条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，进行5 个循环；72 ℃完全延伸5 min。所得扩增产物通过Agencourt AMPure XP纯化，Qubit 3.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，再通过Illumina MiSeq平台进行DNA测序。

1.3.4 挥发性化合物的测定

挥发性化合物的测定采用GC-MS法进行分析，具体参考赵冰等[18]的方法并稍作修改，在5～10 ℃的环境中准确取5 g样品置于20 mL顶空瓶中，将老化后的萃取头插入样品瓶的顶空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入GC进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动GC-MS仪采集数据。

GC条件：色谱柱：DB-WAX毛细管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；载气：He；进样温度：250 ℃；流速：0.8 mL/min；升温程序：在40 ℃保持运行4 min，然后以5 ℃/min的速率升高到90 ℃，再以10 ℃/min的速率升高到230 ℃，保持运行6 min。

MS条件：接口温度：250 ℃；离子源温度：200 ℃；电离方式：电子轰击离子源；发射电流：80 µA；电子能量：70 eV；检测器电压：1000 V。

扫描结果与Wiley、Wileyregistry8e、Replib和Mainlib 4 个 谱库对照进行成分鉴定，参考刘登勇等[13]的方法并稍作 修改，分析正、反匹配度均在900以上（最大1000）的化合物，0.1≤ROAV≤100为西式熏煮火腿的挥发性风味化合物，ROAV计算公式如下。

式中：C为挥发性化合物的相对含量/%；CS为定义的标准挥发性化合物相对含量/%；T为挥发性化合物的感觉阈值/（μg/kg）；Ts为定义的标准挥发性化合物的感觉阈值/（μg/kg）。

ROAV≥1的挥发性化合物为样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的挥发性化合物对样品的总体风味具有重要的修饰作用。

1.4 数据处理与分析

Illumina Miseq得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列。获得的高质量有效序列按97%相似水平进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）分类，通过Coverage指数反映各样品文库的覆盖率，Simpson指数、Shannon指数反映细菌群落分布的alpha多样性[6]。参考Zhang Jian等[19]的方法在SIMCA 14.1软件中执行OPLS-DA，以样品标签为观察值，分别以挥发性化合物、挥发性风味化合物、细菌属与挥发性风味化合物为变量分析分类样品中变量的相似性及差异性，同时通过变量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）来衡量各变量的表达模式对各组样品分类判别的影响强度和解释能力，其中VIP＞1意味着判断变量对模型的重要性。细菌属与挥发性风味化合物之间满足显著相关（|r|＞0.6，P＜0.05）则表明结果是可靠的[20]。采用SPSS 20软件进行相关性分析，使用Origin 2018、SIMCA 14.1和Cytoscape 3.7.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度下细菌群落变化

表 1 样品测序结果的统计分析Table 1 Statistical analysis of sequencing results

由表1可知，采用高通量测序获得了西式熏煮火腿4 ℃前、中期，10、15、20、25 ℃后期7 种样品共245676 条优质序列，根据序列之间97%的相似性将序列 分成不同OTU，共获得个1639 个OTU，平均每种样品含有约234 个OTU。如表1所示，每种样品的覆盖率均在99%以上，表明测序的深度可以准确反映样品细菌群落的真实情况[21]。所有样品中，在4 ℃贮藏中期样品Simpson指数最低，Shannon指数最高，分别为0.06和3.42，物种丰富度达到最高，其次是4 ℃贮藏前期，其Simpson和Shannon指数分别为0.07、3.32，在25 ℃贮藏末期物种丰富程度最低，Simpson指数和Shannon指数分别为0.70、0.77。说明西式熏煮火腿贮藏过程中细菌群落组成到后期趋于单一，贮藏温度越高，越快趋于单一。

图 1 不同贮藏温度下样品属水平的菌群变化Fig. 1 Variation in bacterial community composition at the genus level in samples at different storage temperatures

如图1所示，西式熏煮火腿在不同贮藏温度下相对丰度大于1%的细菌属有21 种，与温冬玲等[6]的研究结果相似，不同贮藏温度下西式熏煮火腿贮藏的各阶段优势菌不同。7 种样品在属水平上主要分为两大类：一类为4 ℃下贮藏前、中期的样品，其品质较好，优势菌是不动杆菌属（24.95%～25.89%）、哈夫尼菌属（10.65%～16.13%）、肠杆菌属（9.19%～11.50%），各细菌属分布较均匀；另一类的品质较差，即为4～25 ℃贮藏后期的样品，菌属分布不均匀，缺乏竞争微生物[22]，其中4 ℃贮藏后期的优势菌是沙雷氏菌属（74.97%）和乳杆菌属（16.70%），10 ℃贮藏后期的优势菌是沙雷氏菌属（60.87%）和耶尔森菌属（36.93%），15 ℃贮藏后期的优势菌是乳酸球菌属（67.64%）和肠杆菌属（11.15%），而20 ℃和25 ℃贮藏后期的优势菌则均为肠杆菌属，相对丰度分别为83.22%和82.76%。Denis等[23]认为蒸煮火腿中大肠菌群的存在是由于热处理后的加工污染。与Vasilopoulos等[24]的 研究结果类似，贮藏温度越高，肠杆菌相对丰度越高， 与Hu Ping等[25]发现真空包装切片火腿在4 ℃贮藏条件下的主要优势菌为乳杆菌不同，这可能是由于本研究中添加的Nisin对其有显著的抑制作用[26]。Gill等[27]在博洛尼亚大红肠中添加Nisin等混合抑菌剂后，将其在8 ℃下贮藏3 周后大肠杆菌数量突然增加，甚至高于空白组。

2.2 不同贮藏温度下挥发性化合物相对含量变化

表 2 不同贮藏温度下样品中挥发性化合物相对含量和感觉阈值Table 2 Relative contents and odor thresholds of volatile compounds in samples at different storage temperatures

续表2

续表2

图 2 基于OPLS-DA模型对不同贮藏温度下样品中挥发性化合物的分析Fig. 2 Analysis of volatile compounds in samples at different storage temperatures by OPLS-DA model

如表2所示，不同贮藏温度下西式熏煮火腿样品的挥发性化合物共91 种，主要以烯烃类（58.50%～66.94%）、芳香族化合物（10.97%～15.26%）、醛类（4.47%～12.85%）和醇类（4.89%～6.21%）为主。如图2所示，与细菌属分类一致，挥发性化合物通过OPLS-DA模型可明显分为两类（坐标图中X＜0和X＞0两部分），包括5 个主成分，模型参数R2X为0.983，说明5 个主成分解释98.3%的X变量；模型参数R2Y为0.997，说明5 个主成分解释99.7%的Y变量；模型预测指数Q2为0.914，说明模型对两类样品的预测能力为91.4%，模型的稳定性及预测能力均较好[28]。在4 ℃前、中期的挥发性化合物主要以杂环化合物、醛类、芳香族化合物和醇类等为主，4～25 ℃贮藏后期的挥发性化合物主要以烯烃类、醚类、酸类、酮类和酯类等为主，贮藏温度越高，越容易生成酸类、酮类和酯类。Lyte等[29]认为烯烃类等碳氢化合物与牛肉中不受欢迎的风味有一定的联系。谢恬等[30]认为醚类化合物在肉制品风味中起着重要作用。García等[8]认为氨基酸可以由具有高蛋白水解活性的微生物（如肠杆菌）释放，微生物发酵氨基酸产生乙酸、丁酸等酸类化合物，大量存在于变质的火腿中，醛类在腐败的干腌火腿中的含量较未腐败的低，同时他们认为变质干腌火腿中的挥发性化合物较未变质的产生更高水平的酮类化合物，这可能是由于沙雷氏菌属、变形杆菌属等代谢所致。Fulladosa等[31]研究发现酯类化合物的含量与干腌火腿空心缺陷强度呈正相关，他们推测高含量的酯类与微生物酯酶活性有关。

2.3 不同贮藏温度下挥发性风味化合物ROAV变化

表 3 不同贮藏温度下样品中挥发性化合物的ROAV Table 3 ROAVs of volatile compounds in samples at different storage temperatures

图 3 基于OPLS-DA模型对不同贮藏温度下样品中挥发性风味 化合物的分析Fig. 3 Analysis of volatile flavor compounds in samples at different storage temperatures based on OPLS-DA model

本实验研究了西式熏煮火腿样品具有感觉阈值的59 种挥发性化合物，其总相对含量为73.19%～77.94%（表2）。表3列举了ROAV≥0.1的所有19 种挥发性风味化合物。如图3所示，通过OPLS-DA模型分析发现挥发性风味化合物亦可显著分为两类，包括5 个主成分，R2X为0.954，R2Y为1，Q2为0.952，说明模型的稳定性及预测能力均较好[28]。一类是4 ℃贮藏前、中期，其关键挥发性风味化合物（ROAV＞1）有月桂烯、D-柠檬烯、愈创木酚、正辛醛、壬醛、芳樟醇，其中愈创木酚化合物是木熏风味主要风味化合物[35]。而4 ℃贮藏前期的挥发性风味化合物以2-正戊基呋喃等为主，其ROAV＜1，Leroy等[10]认为2-正戊基呋喃可能起源于火腿烹饪过程中发生的内源性反应，Benet等[7]则认为其是亚油酸氧化造成的， 导致烤制的肉香气有细微差别，增加熟火腿的整体香气；4 ℃贮藏中期主要以另一种亚油酸氧化产物——正己醛等为主，其ROAV＞1，在含有亚硝酸盐的熟火腿中呈现草香、青苹果味等令人愉悦的气味[36]，然而较高含量的己醛可能会带来令人不愉快的腐烂味道[37]。另一类是4～25 ℃贮藏后期的样品，其关键挥发性风味化合物有乙酸异戊酯、β-石竹烯、茚等。其中4 ℃后期以4-甲基愈创木酚等为主，这意味着4 ℃后期仍有木熏风味[35]，25 ℃后期以乙酸异戊酯、3-羟基-2-丁酮等为主。Lyte等[29]发现3-羟基-2-丁酮是气调包装牛肉在温度滥用下的变质指示化合物，同时他们认为在温度滥用下微生物主要贡献于挥发性化合物次要的组成部分。

2.4 不同贮藏温度下细菌属与挥发性风味化合物相关性分析结果

图 5 基于OPLS-DA模型的VIP分析Fig. 5 Variable importance for the projection analysis based on OPLS-DA model

如图4所示，以细菌属的相对丰度为X变量，挥发性风味化合物的ROAV为Y变量，通过OPLS-DA模型可将样品显著分为两类，有4 个主成分，R2X为0.914，R2Y为1，Q2为0.998，模型稳定性及预测能力均较好[28]。如图5所示，VIP＞1的不动杆菌属等11 种细菌属是两类样品中与挥发性风味化合物相关的差异细菌属。这11 种差异细菌属主要分布在4 ℃贮藏前、中期，随着贮藏时间延长，4～25 ℃贮藏后期差异细菌属相对丰度降至不到4 ℃贮藏前期的32.68%。如图6所示，正己醛的ROAV 与这11 种差异细菌属的相对丰度均显著正相关（r≥0.776，P＜0.05），到贮藏后期，草香、青苹果味等令人愉悦的气味减弱[36]，贮藏温度越高，减弱得越快，25 ℃贮藏21 d正己醛ROAV降低至4 ℃贮藏初期的44%。由于正己醛ROAV与气单胞菌属和链球菌属相对丰度的相关系数最大 （r＝0.868），因此正己醛含量降低除了是因为正己醛与其他降解产物反应外[38]，还可能是因为气单胞菌属和链球菌属等随着贮藏时间延长逐渐没有竞争优势，进而抑制它们生长代谢产正己醛，于美娟等[39]也认为正己醛的生成与微生物代谢有关，游离氨基酸通过脱羧和脱氨的微生物降解产生醛等挥发性化合物[40]。α-蒎烯除了来自火腿腌制过程添加的香料外[41]，因其ROAV与4、10 ℃贮藏后期的优势菌——沙雷氏菌属的相对丰度极显著正相关 （r＝0.896，P＜0.01），所以还可能是其代谢产物月桂烯、癸醛的ROAV与10 ℃贮藏后期的优势菌——耶尔森菌属的相对丰度极显著负相关（r＝-0.938，P＜0.01），月桂烯等单萜烯类因可能作为碳源被耶尔森菌属等分解而 含量减少[42]。García等[8]认为腌渍火腿贮藏过程中醛类由于氧化为相应的酸而含量降低，耶尔森菌属等酯酶活性增加将产生的酸类酯化后使得酯类含量增加。贮藏温度越高，越有益于肠杆菌属和肠球菌属的生长，它们具有很高的变质潜力和食品安全风险，氨基酸代谢和脂质代谢水平升高[43]，肠杆菌属、肠球菌属相对丰度与茚的ROAV极显著正相关（r≥0.952，P＜0.01），肠杆菌的代谢产物还可能包括温度滥用下的变质指示化合物3-羟基-2-丁酮（r＝0.856，P＜0.05）[29]，唐静等[38]在强化高温火腿成熟结束时也发现茚含量显著增加（P＜0.05）。

图 6 细菌属与挥发性风味化合物显著相关（P＜0.05）的网络结构Fig. 6 Network structure showing significant correlation (P ＜ 0.05) between bacterial genera and volatile flavor compounds

3 结 论

通过高通量测序和GC-MS分别测定了4 ℃前、中期及4、10、15、20 ℃和25 ℃后期西式熏煮火腿的细菌群落和挥发性化合物含量。在4 ℃前、中期细菌群落组成丰富，细菌属水平分布均匀，随着贮藏时间的延长，到贮藏后期细菌群落组成单一，4 ℃下优势菌为沙雷氏菌属和乳杆菌属，贮藏温度越高，到后期肠杆菌属相对丰度越高。研究发现样品中挥发性化合物有91 种，包括烯烃类、芳香族化合物、醛类和醇类等。通过OPLS-DA分析发现芳樟醇等19 种挥发性风味化合物（ROAV≥0.1）与细菌属分类一致，样品可显著分为两类，分别为4 ℃贮藏前、中期的样品和4～25 ℃贮藏后期的样品，两类样品间与挥发性风味化合物相关的差异细菌属有不动杆菌属等11 种，它们的相对丰度与正己醛的ROAV显著正相关（r≥0.776，P＜0.05），随着贮藏时间延长，贮藏温度越高，正己醛ROAV下降得越快，到贮藏后期不同贮藏温度下气单胞菌属、链球菌属等竞争力减弱，沙雷氏菌属、乳酸球菌属和肠杆菌属等成为优势菌，其中沙雷氏菌属相对丰度与α-蒎烯的ROAV极显著正相关 （r＝0.896，P＜0.01），肠杆菌属相对含量与茚的ROAV呈极显著正相关（r＝0.980，P＜0.01）。建议将沙雷氏菌属、肠杆菌属等细菌属和正己醛等挥发性风味化合物等作为温度滥用情况下西式熏煮火腿风味保鲜的研究重点因素。