小麦粉及其制品中偶氮甲酰胺检测方法研究进展

田林双，顾鹏程，吴存兵，徐 澳，豆雪梅，史凤珍，陈 飞*

（1.江苏财经职业技术学院粮食与食品药品学院，江苏 淮安 223003；2.南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210023）

偶氮甲酰胺（azodicarbonamide，ADA）是橡胶、泡沫塑料制作中常用的发泡剂[1]，在食品行业中，ADA是小麦粉常用的食品添加剂，最大容许添加量为45 mg/kg[2]。ADA能够氧化小麦粉中的巯基 （—SH）形成二硫键（S—S），使蛋白质链相互连接形成网状结构，从而改善面团成型能力，提高烘焙食品的灵活性和韧性。ADA还可以氧化小麦粉中的天然色素，提高小麦粉白度[3]。在中国、美国、加拿大、巴西等国家，ADA被用作小麦粉增白剂、面筋强化剂和面团调节剂[4]。

图1[5]为ADA在小麦粉储存和加工过程中的化学变化。ADA在干小麦粉中性质稳定，当小麦粉与水混合后，ADA迅速转化为联二脲（biurea，BIU），BIU在常温环境下性质稳定[6]，但在面制品加工过程中，蒸煮、焙烤、油炸等高温环境会促使BIU部分降解为氨基脲（semicarbazide，SEM）[5,7-8]。ADA及其分解产物有潜在的食品安全风险，人吸入ADA可能会导致过敏和 哮喘[9-10]。SEM是兽药呋喃西林的代谢物[11-12]，动物实验证明SEM能够致癌、致畸、致突变，可干扰神经系统和内分泌系统[13-15]。目前，欧盟和澳大利亚、新西兰、新加坡、日本等地区和国家禁止在食品中添加ADA。

图 1 ADA在小麦粉储存和加工过程中的化学变化[5]Fig. 1 Chemical changes of ADA in wheat flour during storage and processing[5]

小麦粉及其制品中ADA的检测方法可分为直接检测法和间接检测法[16]。直接检测法以ADA为目标检测物，间接检测法以ADA分解产物BIU和SEM为目标检测物。ADA在湿热环境下很快转化为BIU[5]，导致小麦粉制品中很难检出ADA，因此ADA直接检测法不能准确反映小麦粉中ADA的初始添加量，需要结合ADA间接检测法进行判断。

近年来，为了简化分析步骤、缩短分析时间、减少大型分析仪器使用、促进检测方法在不同条件实验室的普及并满足快速、现场检测的需要，出现了许多ADA检测新方法[14,16-24]，本文综述了小麦粉及其制品中ADA检测研究进展，分析了当前我国现行ADA检测标准存在的问题，展望了ADA分析检测研究的发展趋势，为ADA分析检测研究与实践提供参考。

1 偶氮甲酰胺直接检测法

1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法发展于20世纪60年代，适用于多种有机化合物的分析检测，在食品、化工、医药等领域应用广泛，目前仪器普及度较高，该法是检测小麦粉及其制品中ADA最常用的方法[25]，我国出入境 检验检疫行业标准SN/T 4677—2016《出口食品中偶氮甲酰胺的测定方法 高效液相色谱法》[26]也采用此方法，该标准采用丙酮作为提取溶剂，使用氰基（—CN）色谱柱，检测波长245 nm，定量限为1 mg/kg，回收率为76%～103.8%。由于ADA性质不稳定，SN/T 4677—2016要求ADA标准工作液和样品溶液的测定应在4 h内完成。关于HPLC法检测小麦粉及其制品中ADA的研究已有多篇文献[27-29]报道，各方法主要在ADA提取与净化、分离条件选择、ADA柱前衍生化3 个方面有所区别。

ADA提取溶剂主要有丙酮[28,30-31]、乙腈[32]、N,N-二甲基甲酰胺[33]和二甲基亚砜[34]。丙酮具有易挥发、毒性低、黏度小等优点，大部分研究者选择丙酮作为提取溶剂。ADA在N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的溶解度较高，但与丙酮相比，提取溶剂N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜不易从样品中分离，残留的提取溶剂对ADA色谱柱分离和紫外检测都会产生较大干扰[35]。

适用于ADA分离的色谱柱主要有C18色谱柱[8,36]、 —CN色谱柱[37-38]和硅胶色谱柱[28]。ADA极性较大，在C18反相色谱柱中保留时间较短[39]，而在—CN色谱柱中更利于分离。ADA最大紫外吸收波长为245 nm，其次为275 nm，大部分研究者选择245 nm作为测定波长[28,40]，但245 nm波长处提取溶剂N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜会产生紫外吸收干扰，因此一些研究者会选择275 nm作为测定波长[34]。

为了进一步提高检测方法的灵敏度，Yasui等[29]采用三苯基膦衍生化ADA，衍生化产物（ADA-三苯基膦）紫外吸收强，色谱柱分离效果好，小麦粉中ADA在0.25～100 mg/kg范围内，与紫外吸收信号呈良好的线性关系，相关系数为0.9999，ADA回收率为86.9%～101.0%，定量限为0.25 mg/kg，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.9%～3.4%。

1.2 荧光比色法

与HPLC法相比，荧光比色法具有操作简便、直观、成本低、灵敏度高、选择性好等特点。Chen Junyang等[19]合成基于硅纳米颗粒（silicon nanoparticle，SiNPs）和量子点（quantum dot，QDs）的荧光探针（SiNPs@QDs）（图2），该探针在445 nm和632 nm波长处分别有两个分辨率良好的发射峰。632 nm波长处的荧光峰可被汞离子（Hg2+）猝灭，而在还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）存在的情况下，GSH的—SH与Hg2+亲和力更强，632 nm波长处的荧光峰又被恢复。添加ADA后，GSH的巯基被氧化成S—S，生成氧化型GSH（glutathione oxidized，GSSG），Hg2+重新释放出来，引起632 nm波长处的荧光再次猝灭，而SiNPs@QDs在445 nm波长处的荧光强度始终不变。该方法的ADA浓度在0.05～4 μmol/L 范围内，与荧光强度比（F632nm/F445nm）存在良好的 线性关系，相关系数为0.995。该法检测小麦粉中ADA的检出限为1.86 μg/kg，回收率为96.3%～104%，RSD为4.6%～8.3%。

图 2 荧光探针SiNPs@QDs制备过程与ADA检测原理[19]Fig. 2 Schematic diagram displaying the preparation of SiNPs@QDs probe and the mechanism for ADA detection[19]

1.3 分光光度法

分光光度计价格便宜，是各级实验室常用的分析仪器。基于该设备，Chen Zhiqiang等[16]开发了一种基于肉眼观察或者可见光分光光度计定量小麦粉中ADA浓度的方法（图3）。GSH与金纳米颗粒（gold nanoparticle，AuNPs）通过Au—SH共价交联，形成网络结构，引起AuNPs聚合而产生颜色变化。ADA与GSH反应，使GSH失去—SH基团，从而降低AuNPs的聚合度，导致AuNPs分散。该法检测时间仅为2 h，当ADA浓度大于0.33 µmol/L 时，肉眼即可明显观察到颜色变化。借助可见光分光光度计，ADA检出限可低至0.23 µmol/L。该法用丙酮超声提取小麦粉中ADA，氮吹浓缩，过膜检测，仅依靠肉眼观察，小麦粉中ADA检出限为5.86 μg/g，借助分光光度计，ADA检出限为3.5 μg/g，回收率为91%～104%，RSD为4%～6%[16]。综上，分光光度法使用仪器少、成本低、速度快，适用于现场检测。

图 3 AuNPs分光光度法检测ADAFig. 3 Visual detection of ADA based on ADA-induced anti-aggregation of gold nanoparticles[16]

1.4 红外光谱法

红外光谱（infrared spectroscopy，IR）技术具有样品前处理简单、样品破坏少、对环境友好、一次分析可获得样品中多个组分信息等优点，已广泛应用于多种物质的定量、定性分析。早在1983年，Osborne[41]同时测定了小麦粉中抗坏血酸、ADA和半胱氨酸含量。Gao Shang等[42]用近红外光谱结合径向基函数法对小麦粉中的ADA进行定量分析，对ADA含量较低的样品进行二次建模，显著提高了预测精度。Che Wenkai等[23]对101 个不同ADA含量的小麦粉样品进行光谱扫描，得到400～2498 nm波长范围的光谱数据，选取4 个波段（400～438、1480～1852、1896～1938、2048～2380 nm）作为特征波段，采用径向基函数建立预测模型，小麦粉中ADA检出限为3.2 mg/kg，相关系数、均方根误差、模型性能指数分别达到0.99996、0.5467、116.5858。

1.5 高光谱成像法

高光谱成像技术融合了光谱技术和机器视觉技术，采集的高光谱图像包含物质的光谱信息和图像信息，能够实现样品内外部物质成分的定性分析、定量分析和可视化表达[43]。关于小麦粉中ADA高光谱成像技术检测，王晓彬等[20]找出了小麦粉中ADA的4 个特征吸收波段，分别为1574.38、2038.55、2166.88 nm和2269.91 nm，采用光谱相似性分析对单像素点光谱进行计算，该法可以对不同ADA添加量的小麦粉进行分类。其还采用二值图像重构算法，对不同ADA添加量的小麦粉进行识别，ADA像素与ADA含量呈良好的线性关系，相关系数为0.9845，ADA检出限为0.2 g/kg。

1.6 太赫兹时域光谱法

太赫兹（terahertz，THz）波是指波长为3000～30 μm范围内的电磁波，在长波段与毫米波相重合，在短波段与红外光重合，太赫兹时域光谱（terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS）法能够获取物质的物理结构和化学成分等重要信息。THz-TDS法辐射能量小，不会对被测物质产生破坏，适用于样品无损检测[44]。 方虹霞等[45]比较分析了纯ADA、纯小麦粉以及混有ADA小麦粉的THz-TDS，发现ADA在1.93 THz处有一个明显的特征吸收峰，选择偏最小二乘法定量分析小麦粉中ADA，相关系数达0.9999，标准误差为0.06%，小麦粉中ADA检出限为1.1 g/kg。GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[2]规定ADA在小麦粉中的最大容许添加量为 45 mg/kg，目前该法灵敏度较低，还需要对其进行改进。

1.7 表面增强拉曼光谱法

与IR信号相比，大多数样品的拉曼光谱信号较弱，这客观上限制了拉曼光谱的应用和发展。但当样品吸附于具有纳米量级粗糙度的金、银等金属结构表面时，样品分子的拉曼光谱信号将得到极大的增强。 自20世纪70年代表面增强拉曼光谱（surface enhancement Raman spectroscopy，SERS）法被首次报道以来，其应用受到了广泛的关注。SERS法具有灵敏度高、选择性强、无荧光等特性[46]，在食品安全、环境保护等领域具有广阔的应用前景[47]。Li Menghua等[48]合成具有强等离子体共振的银包金纳米粒子（Au@AgNPs）（图4），Au@AgNPs对含NH2的ADA有较强的吸附作用，ADA的拉曼光谱信号因此获得显著增强，即使ADA的浓度低至1×10-7mol/L，也能产生较为明显的拉曼光谱信号，其建立了一种简便、快速、灵敏、廉价、无标记的ADA检测方法，水、小麦粉、馒头样品中ADA的检出限分别为11.6 μg/kg、1.16 mg/kg和2.32 mg/kg，回收率在81%～95%之间。

图 4 Au@AgNPs SERS法检测ADA[48]Fig. 4 Surface enhancement Raman spectroscopic detection of ADA using Au@AgNPs as Raman amplifier[48]

1.8 电化学分析法

电化学分析法基于电化学原理和物质的电化学性质，借助电化学分析系统来实现物质的分析检测。相对于色谱、光谱、质谱等仪器，电化学分析法仪器操作简单、价格低廉。赵常志等[22]利用ADA在Nafion膜电极上的伏安响应，用差分脉冲伏安法测定小麦粉中ADA质量浓度。ADA质量浓度在0.93～10.5 μg/L之间，与Nafion膜电极的电流响应呈线性关系，相关系数为0.9992，ADA检出限为0.58 μg/L。该法检测小麦粉中ADA的检出限为5.8 μg/kg，回收率为95.8%～104%，RSD小于5.9%。

2 基于联二脲检测的偶氮甲酰胺间接检测法

与ADA相比，BIU少了一个生色基团C＝C，因此，BIU的紫外吸收性能降低，荧光吸收与发射灵敏度减弱，配备紫外、荧光检测器（fluorescence detector，FLD）的液相色谱（liquid chromatography，LC）难以用于BIU分析检测。目前对于小麦粉及其制品中BIU的检测研究报道较少，已报道的文献中均使用液相色谱-质谱 （LC-mass spectrometer，LC-MS）联用仪（表1），电离源选用电喷雾电离源（electrospray ionization，ESI）或大气压化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI），质谱质量分析器选用四极杆质量分析器。根据是否对BIU进行衍生化，分为BIU直接测定和BIU衍生后测定。

BIU在常见的C18色谱柱中分离效果差，大部分研究者选用氨基色谱柱，Mulder等[49]采用TSK酰胺类柱，用13C,15N2-SEM和13C-氰化钾合成了内标标准物13C,15N2-BIU， LC-MS法测定包裹小麦粉的禽肉和海产品中BIU，检出限为10 μg/kg。Lim等[50]测定小麦粉和焙烤食品中的BIU，比较了质谱仪ESI正离子和负离子两种电离模式，结果表明BIU对ESI正离子模式敏感度更高，样品中BIU检出限为3 μg/kg。袁丽红等[51]建立了小麦粉和馒头中BIU的检测方法，采用固相萃取净化BIU提取溶液，去除溶液中杂质，减弱了离子抑制，因此该法不需要价格昂贵的同位素内标，BIU的线性范围为0.5～20 μg/kg，相关系数为0.9992，检出限为0.1 μg/kg。阮莎莎[52]测定小麦粉、馒头、面包、油条和面条中BIU，采用纯水直接提取样品中BIU，对于油条等油脂含量较高的样品，用乙腈饱和的正己烷脱脂，采用同位素内标法定量，BIU质量浓度在0.2～100 μg/L范围内，线性良好，相关系数为0.9999，BIU检出限为5 μg/kg。赵悠悠等[53]认为普遍采用的ESI对BIU的电离效果没有APCI效果好，其采用HPLC-APCI-MS测定面包中BIU。该法比较了水、甲醇、乙腈、5% DMF-水溶液4 种溶剂对面包中BIU的提取效果，结果表明80 ℃热水超声提取效果最佳。面包中BIU在0.2～10.0 mg/kg范围内，线性良好，检出限为 0.15 mg/kg，回收率为82%～110%，RSD为3.3%～4.1%。

为了进一步提高BIU在质谱检测器中的响应，王雅等[54]用高锰酸钾把BIU氧化为ADA，再用甲苯亚磺酸钠对ADA进行衍生化，LC-MS法测定衍生化产物，用该法检测小麦粉、馒头、面包、油条、方便面中BIU，样品中BIU在1～20000 μg/kg之间，线性良好，相关系数为0.9999，BIU检出限低至0.15 μg/kg，回收率为78.3%～108.0%，RSD小于5.73%。

表 1 LC-MS法检测小麦粉及其制品中ADA转化产物BIUTable 1 Determination of ADA decomposition product BIU in wheat flour and its products by liquid chromatography-mass spectroscopy

3 基于氨基脲检测的ADA间接检测法

3.1 液相色谱-串联质谱法

液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法仪器灵敏度高，适用于痕量物质定性与定量分析，用该法检测SEM，检出限一般低于1 μg/kg，是食品中SEM检测的首选方法[55]。SEM以游离和结合两种形式存在于食品基质中，酸法提取可以释放食品基质中全部的SEM[8,56]。SEM的相对分子质量为75，ESI基体干扰大、灵敏度较低，用2-硝基苯甲醛过夜衍生化后，衍生物电离效率和在反相色谱柱中的保留能力均有提升[8]。HPLC-三重四极杆质谱是 LC-MS/MS法检测小麦粉及其制品中SEM常用的仪器，该法首先将小麦粉及其制品中的ADA进行湿热处理，使ADA转化为SEM，然后用2-硝基苯甲醛衍生化SEM，最后通过测定SEM衍生化产物的量来间接计算ADA含量[8,56-58]。 为了进一步提高方法的灵敏度，黎娟等[59]用HPLC-四极杆/离子阱质谱测定小麦粉及其制品中SEM，检出限低至0.1 μg/kg。虽然LC-MS/MS法高度灵敏，但也存在繁琐、耗时、仪器昂贵等缺点，不利于方法的普及。

3.2 高效液相色谱法

HPLC法检测小麦粉及其制品中ADA转化产物SEM，常用紫外检测器（ultraviolet detector，UVD）或FLD（表2）。SEM紫外响应和荧光响应均较差，需要对SEM进行衍生化，在SEM上引入紫外发色基团或荧光敏感的化学基团。Wei Tianfu等[60]以4-硝基苯甲酰氯为衍生化试剂，室温下1 min内即可完成SEM衍生化反应，与 LC-MS/MS法常用的衍生化试剂2-硝基苯甲醛（衍生化SEM需要16 h）相比[8]，4-硝基苯甲酰氯衍生化SEM的效率提高了数百倍。衍生化产物在C18柱上的保留能力和紫外吸收均有较大幅度提升，SEM质量浓度在0.01～2.0 mg/L 范围内，与紫外吸收信号呈良好的线性关系，相关系数为0.9991，SEM检出限为1.8 μg/kg，可应用于小麦粉及其制品中痕量SEM的快速测定。HPLC中FLD灵敏度一般比UVD灵敏度高1～3 个数量级[55]，Kong Xiaojian等[18]以2-甲酰基苯硼酸为衍生化试剂，应用于面包、方便面、虾等食品中SEM的测定，SEM检测限为0.18 μg/kg。 Li Guoliang等[61]以2-(11-氢-苯并[a]咔唑)-乙基氯甲酸酯）为衍生剂，SEM检出限为0.4 μg/kg。Wang Yinan等[62]以芴甲氧羰酰氯为衍生化试剂，SEM检出限为0.15 μg/kg， 该方法与常见LC-MS/MS检出限（0.1～0.8 μg/kg）相当。章建辉等[63]测定小麦粉中ADA，小麦粉湿热处理后，丹磺酰氯衍生化ADA分解产物SEM，采用 HPLC-FLD测定，小麦粉中ADA检出限为30 μg/kg。

表 2 HPLC法检测小麦粉及其制品中ADA转化产物SEMTable 2 Determination of ADA decomposition product SEM in wheat flour and its products by high performance liquid chromatography

3.3 电化学法

电化学法仪器价格低廉、操作简单，随着便携式电化学工作站的普及，该法在现场检测方面有较大应用潜力。Zhu Yudan等[17]采用微分脉冲伏安法测定小麦粉中SEM，2-硝基苯甲醛衍生化SEM，用微分脉冲伏安法对衍生化产物进行定量，SEM质量浓度在0～100 µg/L范围内，与峰值电流呈线性关系，相关系数为0.999，小麦粉中SEM检测限为3 μg/kg，回收率为92%～99%，相对标准偏差小于4.3%。与HPLC、LC-MS/MS法相比，该法具有有机溶剂消耗少、分析成本低等优点。

4 偶氮甲酰胺及其分解产物同时检测

Xie Yunfei等[64]采用SERS法对小麦粉中ADA、BIU和SEM 3 种化学物质进行同时检测，检测限为10 μg/g，该方法可以用于小麦粉及其制品中ADA和BIU分析检测。SEM在小麦粉及其制品中的含量一般低于1 μg/g，因此SERS法不适用于小麦粉及其制品中SEM检测。Chen Li等[14]采用毛细管电泳同时分析小麦粉中ADA和SEM，并对毛细管电泳分离条件、萃取剂和衍生化条件进行了研究。在四硼酸钠、β-环糊精、异丙醇、十二烷基硫酸钠缓冲液中，25 min内ADA和SEM即可分离，ADA 和SEM的线性范围分别为8.3×10—4～6.6×10—2mmol/L和1.9×10—3～3.4×10—2mmol/L，小麦粉中ADA和SEM的检出限分别为0.15 mg/kg和0.045 mg/kg。该方法成功地应用于5 个小麦粉样品中ADA和SEM的同时检测。ADA的回收率为88.0%～93.0%，RSD为0.8%～3.0%。SEM的回收率为98.0%～106.0%，RSD为3.1%～9.1%。该法分离性能与HPLC法相当，可作为HPLC法的替代方法。

5 结 语

我国现行小麦粉及其制品中ADA检测标准需要进一步完善。GB 1886.108—2015《食品安全国家标准 食品添加剂 偶氮甲酰胺》[65]采用硫代硫酸钠标准溶液滴定方法检测ADA食品添加剂中高含量的ADA，对于小麦粉及其制品中ADA添加量的检测，目前还没有国家标准。SN/T 4677—2016[26]采用HPLC法直接测定小麦粉及其制品中ADA。小麦粉长期存放和面制品制作过程中，ADA遇水快速转化为BIU。甚至在ADA提取、分析检测过程中，也同时伴随ADA的转化反应，ADA直接检测法不能准确反映小麦粉中ADA的初始添加量。SN/T 4677—2016[26]要求ADA标准溶液和样品溶液的测定必须在4 h内完成，用该方法检测ADA标准添加量为1 mg/kg的小麦粉，回收率较差，这可能与分析检测过程中ADA的转化有关。可以设想，ADA标准添加量为1 mg/kg的小麦粉长时间放置后，回收率会更低。ADA遇水转化为BIU后，BIU性质稳定，只有极少部分转化为SEM，BIU可作为小麦粉及其制品中是否添加ADA的标记物质。目前关于小麦粉及其制品中BIU检测研究报道较少，对该领域的研究值得研究者关注。

基于SEM衍生的HPLC法具有较大的推广应用价值。SEM在小麦粉及其制品中含量极低，HPLC-MS/MS因为其高灵敏度特点，目前是SEM检测的主要设备。HPLC-MS/MS 法检测小麦粉及其制品中SEM，首先提取样品中的SEM，再进行过夜衍生反应，用同位素SEM内标定量，最后采用HPLC-MS/MS法检测，该过程耗时长、成本高。4-硝基苯甲酰氯[60]和芴甲氧羰酰氯[62]能够快速衍生化SEM，分别用更为普及的HPLC-UVD和HPLC-FLP进行检测，SEM检出限与HPLC-MS/MS基本相当。基于SEM衍生化的HPLC-UVD和HPLC-FLP具有较大的研究空间，高灵敏度、快速稳定的衍生化试剂开发是该研究的核心内容。

光谱学方法是快速、无损、现场检测小麦粉及其制品中ADA的有效手段。与HPLC-MS/MS、HPLC等化学分析法相比，光谱学方法具有快速、无损、低廉等诸多优势。此外，光谱学方法能同时获得多个物质组分信息，实现ADA、BIU和SEM的同时检测。目前IR、 THz-TDS、SERS等光谱学方法已经用于小麦粉及其制品中ADA的检测，但普遍存在预测精度和灵敏度不足等问题，需要在光谱数据收集与分析、方法建模等方面进一步深入研究。