攀枝花不同海拔高度烤烟农田红壤中氨氧化细菌与氨氧化古菌的群落结构分析

张 静,杨 鹏,余 伟,张亚洁,封 俊,闫芳芳,张宗锦,辜运富,*

1 四川农业大学资源学院, 成都 611130 2 四川省烟草公司攀枝花市公司, 攀枝花 617099

氮素循环是自然生态系统重要的物质循环过程,由微生物代谢驱动的多种生物化学反应所组成[1]。土壤氮循环与植物生产力密切相关。土壤生态系统中,硝化过程是土壤氮循环的重要环节,其中,微生物驱动的氨氧化过程是硝化作用的第一步和限速步骤,对植物生长所需的氮元素起着关键作用[2]。氨氧化过程中发挥关键作用的是编码氨单加氧酶的amoA基因,可将NH3氧化成NH2OH,供植物吸收利用[3]。土壤氨氧化的主要功能菌群为氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea, AOA)[4- 5]。AOA和AOB在海洋[6]、土壤[7]和淡水[8]等生态环境中的广泛分布,更表明了其在硝化过程中的主导地位[9]。因此探究生态系统中AOA与AOB群落结构的差异及其与环境因子的关系对深入认识生态系统氮素生物地球化学循环特征及其微生物学机制具有重要意义。

近年来,土壤氨氧化微生物群落的地理分布及驱动因素的研究受到广泛关注。路璐等(2018年)研究表明,在土壤理化性质和硝化潜势显著差异的不同林分土壤中,氨氧化微生物群落结构存在明显的分异特征,土壤总氮和有机质为主导驱动因子[9]。王晓胡等研究发现,贡嘎山不同海拔梯度气候和土壤性质的综合作用可能是引起AOA和AOB数量及丰度变化的因子,且AOA和AOB数量具有极强的空间异质性[10]。AOA与AOB是影响土壤氮循环的重要因素,其群落结构受到不同养分因子的影响,关于不同生态环境中AOA与AOB 分布规律的研究已有较多报道,但由于研究区域的不同,得出的结论也有所差异。目前针对干热河谷区海拔对农田土壤AOA与AOB群落结构影响的研究还相对较少[9- 11]。

攀枝花地处干热河谷山地地形区,区域内的气候、植被和土壤理化性质沿海拔呈现出规律的变化。同时,该地常年为烤烟种植区,因化肥施用不当导致土壤退化、板结,土壤环境恶化,烟叶品质下降。研究表明,氮素中的硝态氮与铵态氮含量对烟草的生长、产量及品质具有非常重要的作用,由AOA与AOB驱动的硝化作用在氮素循环过程中起着关键作用[12]。因此,攀枝花不同海拔高度烤烟农田红壤区为开展AOA、AOB与环境相互作用的研究提供了理想场地[10]。随海拔升高、温度降低等环境条件可能对AOA与AOB生存适应性和群落结构产生一定的影响[13]。因此本文以攀枝花米易县干热河谷地区农田红壤为研究对象,运用化学分析和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析该区域不同海拔高度农田红壤AOA和AOB群落结构的差异及其养分驱动因子,为深入研究该区域不同海拔高度红壤氮素循环过程和土壤培肥管理等提供依据。

1 研究区域与样地概况

攀枝花米易县地处四川省西南部,青藏高原东南边缘,安宁河谷下游,北纬26°42′—27°10′,东经101°41′—102°15′,为亚热带干热河谷气候,雨热同期,光照时数 2217.3—2413.5 h,热量、光照充足,年降雨量1100 mm,降水丰沛[14]。主要土壤类型为酸性红壤[15]。

于2019年4月在米易县坪山乡3个海拔高度：1600 m,1800 m,和2000 m的红壤农田耕作区进行土样采集,种植制度为雨季(4—9月)种植烤烟,旱季空闲(10月至第二年3月),烤烟品种为云烟87。在每个海拔高度分别设置6个采样区,采样区大小约为50 m×50 m,且之间至少间隔100m。在每个采样区按“五点采样法”原则进行表层土壤(0—20 cm)的采集,采样时先去除根和砂砾等杂质、充分混匀,然后装入无菌采样带并放置于冰盒中带回实验室。将土样分成2份,一份自然风干后磨碎过20目筛后用于土壤理化性质分析,另一份新鲜样品立即进行土壤总DNA的提取。

2 材料和方法

2.1 土壤理化性质测定

2.2 土壤总DNA的提取

利用 Fast DNA® SPIN Kit for Soil试剂盒,按照试剂盒说明书给定操作步骤进行土壤总 DNA 的提取,经琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度后,置于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.3 末端限制性片段多态性分析(T-RFLP)

采用ABI PCR 9700 扩增仪进行扩增。每对正向引物5′末端带有 6-FAM 荧光标记。AOA和AOB引物分别为Arch-amoAF/Arch-amoAR(5′-ATGGTCTGGCTAAGACGMTGTA/ GCGGCCATC- CATCTGTATGT- 3′)和amoA- 1F/amoA- 1R(5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG/ GCGGCCATCCATC-TGTATGT- 3′)[10]。AOA功能基因扩增反应体系(25 μL)如下：2×PCR Master Mix(ABI,USA)12.5 μL,引物各 0.5 μL,DNA模板3 μL,无菌双蒸水补足至25 μL。AOB功能基因扩增体系(25 μL)如下：2×PCR Master Mix(ABI,USA)12.5 μL,引物各 0.5 μL,DNA模板 3 μL,无菌双蒸水补足至25 μL。PCR扩增反应程序如下：94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 1 min,53 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸 1 min,共34个循环；72 ℃最终延伸 10 min。

扩增后的PCR产物用限制性内切酶(HhaI)进行酶切,酶切体系：PCR产物10 μL,无菌双蒸水18 μL,10 x Buffer Tango 2 μL,HhaI2μL。37 ℃酶切16h,之后在80 ℃失活30min。将酶切产物送至生工生物有限公司进行毛细管电泳测定。

2.4 数据处理

通过 SPSS25.0 软件的单因素方差分析(ANOVA)检测不同海拔高度土壤理化性质的差异(P<0.05)。运用Excel 2010计算对AOA和AOB的多样性指数及群落结构[17]。使用CANOCO5.0软件对AOA与AOB进行非度量多维尺度分析(Non-metric Multidimensional Scaling, NMDS)及冗余分析(redundancy analysis,RDA)。

3 结果与分析

3.1 海拔高度对土壤理化性质的影响

由表1可知,随海拔高度的增加,土壤理化性质总体上呈现降低的趋势。三个海拔高度的土壤均呈弱酸性(pH5.5—6.5),与海拔1600 m的土壤相比,pH随海拔高度增加而增加,但均未达到显著差异。土壤有机碳、全氮和速效钾含量随海拔升高而降低,且在1600 m与2000 m的土壤达到显著差异(P<0. 05)。碱解氮和有效磷含量随海拔的升高呈先增加后降低的趋势,但均未达到显著差异。铵态氮含量在低海拔(1600 m)的土壤中含量最高,但各海拔高度之间无显著差异(P>0.05),而硝态氮含量在中海拔(1800 m)的土壤中含量最高,且与其他两个海拔高度差异显著(P<0. 05)。海拔高度的变化在一定程度上改变了土壤环境,尤其是对土壤有机碳、全氮、速效钾及硝态氮影响较大。总体而言,中等海拔的土壤具有较高的肥力水平。

表1 攀枝花干热河谷不同海拔高度农田土壤的理化性质

3.2 海拔高度变化对土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落结构的影响

3.2.1不同海拔高度土壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落结构的变化

不同海拔高度AOA、AOB群落NMDS分析结果如图1所示,AOA与AOB群落结构随海拔高度变化表现出不同的变化规律,AOA的群落结构较AOB分异明显。AOA群落在各海拔内聚集相对集中,在三个海拔的群落结构相对独立,表明不同海拔高度下AOA群落结构分异明显。而在不同海拔高度下AOB分异变化更大,1600 m和1800 m的AOB群落集中且部分重叠,在2000 m时,AOB群落与1600 m和1800 m间隔较大。总体而言,不同海拔高度下AOA群落结构较AOB群落结构分异更明显。

图1 同海拔高度下AOA和AOB群落结构差异图Fig.1 Community structure variation of AOA and AOB at different elevations

3.2.2海拔高度变化对氨氧化古菌和氨氧化细菌群落多样性的影响

由表2可知,海拔高度变化影响土壤AOA和AOB群落的多样性。就AOA而言,多样性指数随海拔高度的增加而增加,在高海拔(2000 m)的土壤中达到最大值。与低海拔(1600 m)的土壤相比,Shannon多样性指数在2000 m时达到显著差异(P<0.05),丰富度在1800 m时达到显著差异(P<0.05),均匀度随海拔的增加无显著变化。而海拔高度变化对AOB多样性指数的影响有所不同,AOB的Shannon多样性指数和均匀度随海拔的增加呈先增加后降低的趋势,在中海拔(1800 m)土壤中最高,显著高于低海拔土壤(P<0.05),而丰富度随海拔的增加呈先降低后增加的趋势,在中海拔(1800 m)土壤中最低,显著低于其他两个海拔的土壤(P<0.05)。此外,三个海拔高度的土壤中,AOA的多样性指数均高于AOB。

表2 不同海拔高度下红壤中 AOA 和 AOB多样性指数

3.2.3氨氧化古菌和氨氧化细菌群落组成对海拔高度变化的响应

对不同海拔高度的土壤AOA和AOB群落结构进行T-RFLP分析(如图2),结果表明, 在三个海拔高度的土壤中,AOA的T-RFs多于AOB。其中, 260bp、270bp的T-RFs是AOA中的优势片段,相对丰度分别为2%—11%、5%—12%。270bp的T-RFs随海拔增加呈现先增加后减少的趋势。260 bp的T-RFs随海拔地增加呈先减少后增加的趋势。通过从NCBI网站中数据库的比对发现,270 bp的T-RFs属于亚硝基球菌属(Nitrososphaera),而其余大部分T-RFs片段未能找到明确的类别。AOB 酶切后得到6个T-RFs片段,60 bp的T-RFs是三个海拔梯度的优势片段,相对丰度分别为45.60%、45.51%、43.84%。65bp的T-RFs在3个海拔中的相对丰度为19.52%、17.45%、25.77%。其中,60 bp、65bp和80 bp的T-RFs 分别为亚硝化螺菌属 (Nitrosospira)、亚硝化单胞菌属 (Nitrosomonas)和硝化弧菌属 (Nitrosovibrio)。

图2 不同海拔高度下AOA和AOB基因末端限制性片段(T-RF)的相对丰度对比Fig.2 Comparison of relative abundance of AOA and AOB terminal restriction fragment (T-RF) under different treatments

3.3 不同海拔高度红壤氨氧化古菌和氨氧化细菌群落结构相对丰度与土壤理化性质之间的关系

对AOA和AOB群落结构相对丰度与土壤理化性质之间的RDA结果如图3所示,图中箭头表示养分因子,箭头所处的象限表示养分因子与排序轴间的正负相关性,箭头连线长度表示该养分因子与样本分布相关程度的大小,箭头连线间的夹角代表养分因子间的相关程度[18]。第一轴与第二轴分别解释了16.44%和14.70% AOA的群落结构相对丰度变化,61.94%和6.95% AOB群落结构相对丰度变化。不管是AOA还是AOB,均与土壤速效钾、有机碳和硝态氮显著相关(图3),显示土壤硝态氮、速效钾和有机碳是影响攀枝花干热河谷农田红壤AOA和AOB群落结构变异的主要养分因子。

图3 不同海拔高度红壤中氨氧化微生物 AOA和 AOB与养分因子变化的 RDA 排序Fig.3 RDA sequencing of AOA and AOB and nutrient factors in red soil at different altitudesSOC为有机碳,TN为全氮,AN为碱解氮,AP为有效磷,AK为速效钾,为硝态氮,铵态氮

4 讨论

不同海拔高度下气候等因素的影响通过改变土壤理化性质直接影响AOA、AOB的群落结构组成及丰度。研究表明,土壤有机质、pH、有效氮、有效磷及有效钾等理化指标均与海拔呈显著的相关性[11]。李相楹等在研究不同海拔高度下梵净山土壤碳、氮、磷分布特征时表示,土层中有机质与海拔高度显著相关,有机质含量随海拔高度增加呈先增加后降低趋势,这主要是因为伴随海拔高度增加,土壤温度和水分降低,且植被丰富度和地上生物量也降低所致[19]。但王琳等研究显示,随海拔高度增加水分适宜但温度较低,土壤微生物活动受到抑制,利于有机质的积累[20]。此外,土壤有机质含量还受其他因子的影响。本文中,随海拔高度增加,土壤有机碳逐渐降低,这在很大程度上也是由于海拔升高改变了土壤温度和水分含量,而导致土壤有机质含量降低。土壤有机质的变化直接会影响土壤多种营养元素的含量,有机质分解释放氮、植物生长消耗氮,因此,随海拔高度的上升土壤全氮含量也是呈现逐渐降低的趋势[21]。但是斯贵才对藏东南森林土壤微生物群落结构与土壤酶活性随海拔梯度变化时表示土壤中硝态氮随海拔高度增加无显著变化[22]。而本文中,硝态氮含量随海拔高度增加呈先增加后减少趋势,在中海拔(1800 m)与高海拔(2000 m)和低海拔(1600 m)差异显著。这可能是因为在中海拔高度降雨较少,硝态氮不易随水分流失,从而导致在中海拔高度土壤中硝态氮含量较其他海拔差异显著。综上所述,海拔高度变化对土壤理化性质影响较大。

Zhang等研究发现,土壤中AOA、AOB群落组成及相对丰度伴随海拔升高呈现不同的变化规律。在较低海拔土壤中,AOA群落组成及相对丰度明显高于AOB；而在高海拔土壤中,AOB群落组成及相对丰度明显高于AOA[23]。但王晓胡对贡嘎山不同海拔梯度土壤氨氧化微生物数量空间分异特征中表示,AOA、AOB丰度在低海拔土壤中无显著差异,但在高海拔土壤中AOA数量明显高于AOB[10]。本文中,在三个海拔高度中,AOA群落组成及相对丰度均高于AOB。Leininger及贺纪正等研究发现在大多数酸性土壤中,AOA的群落组成及丰度高于AOB[24- 25]。本文中土壤pH呈现弱酸性,因AOA对酸性环境下相比AOB具明显的竞争优势,从而使得AOA丰度较AOB更高。此外,AOA多样性指数随海拔升高而增加,而AOB多样性随海拔高度增加呈先增加后减少趋势。在Di等研究中发现AOA和AOB生长的土壤氮素含量不同,AOA倾向于低氮环境而AOB对高氮环境更适应[26]。本文土壤全氮含量随海拔升高而降低,一定程度上对AOA所需的低氮环境更接近；而硝态氮在中海拔(1800 m)与高海拔(2000 m)和低海拔(1600 m)差异显著,且随海拔升高呈先增加后降低趋势,因此在中海拔(1800 m)时更接近AOB所需的高氮环境。总体而言,AOA群落组成及相对丰度较AOB丰富,随海拔高度增加,AOA、AOB多样性呈现不同的变化规律。

研究表明,土壤理化性质与AOA、AOB群落结构及相对丰度有一定的相关性,并且能够影响土壤AOA、AOB的数量[27]。土壤中增施氮肥可以提高AOA和AOB的丰富度及多样性[28]。杨亚东在研究施氮肥对华北平原土壤氨氧化细菌和古菌数量及群落结构的影响时发现,增施铵态氮显著改变了AOA和AOB的群落结构且对AOA数量的影响更为显著[29]。而Di等研究认为AOA的数量不会随着铵态氮肥的施加而变化,但AOB数量与硝态氮含量呈显著正相关[26]。本文中通过冗余分析(RDA)发现,不论是AOA还是AOB的群落结构和相对丰度都与土壤中硝态氮含量显著相关。与杨亚东的研究结果一致。Subrahmanyam等研究发现AOA对氨氮的亲和力较AOB高,显示出AOA在氨氧化过程中具有更高竞争能力[30]。本文中,随海拔高度增加土壤中全氮含量总体呈现降低趋势,AOB生长所需养分含量减少,从而AOB的群落结构相对丰度降低,这与AOB对高氮更有耐受力的观点一致。罗培宇等在研究长期施肥对棕壤AOA、AOB丰度的影响时发现速效钾与土壤中AOA、AOB丰度呈正相关[31]。这是因为长期耕作、施肥等对农田土壤的化学性质产生改变,从而影响了AOA、AOB的群落结构及相对丰度对环境的不同响应。与本研究结果相似,显示速效钾同样是影响干热河谷区域农田红壤AOA和AOB群落结构发育的重要养分因子。

5 结论

本文运用化学分析和末端限制性片段长度多态性对攀枝花干热河谷区不同海拔农田红壤的养分特性和AOA及AOB群落结构进行了分析。结果显示该区域的农田红壤均呈弱酸性,土壤养分、AOA及AOB群落结构和多样性均随海拔升高出现明显变化。伴随海拔高度增加,AOA多样性增加而AOB则是先增加后降低。AOA以亚硝基球菌属(Nitrososphaera)为优势菌群而AOB中优势菌群为亚硝化螺菌 (Nitrosospira),二者相对丰度值随海拔高度增加表现为先增加后降低的趋势。土壤硝态氮、速效钾和有机碳是影响该区域AOA与AOB群落结构变化的主要养分因子。

致谢：感谢中国科学院成都生物研究所李超男博士对数据分析的帮助,感谢攀枝花市烟草公司对采样的帮助。