抗中性粒细胞胞浆抗体在儿童闭塞性细支气管炎中的临床意义

陈晓雯 吴上志 谢娜 刘文宽 林育能 陈涛 牛学锋 蔡勇 张亚文陈德晖

1广州医科大学附属第一医院儿科510120;2广州呼吸健康研究院510120

谢娜现在湖南省妇幼保健院,长沙410008

闭塞性细支气管炎 (bronchiolitis obliterans,BO)是一种累及细支气管的慢性阻塞性肺部疾病,多见于严重感染、异体移植、急性肺损伤和自身免疫性疾病[1-2]。儿童BO 的发病与成人不尽相同,其发生发展多与下呼吸道感染相关,被认为是急性呼吸道病毒感染后遗症,其中1%急性毛细支气管炎患儿可发展为感染后BO[3-4]。目前儿童BO 诊断手段不多,病理是确诊的金标准,临床更多依赖于排他性诊断,尚缺乏特异性的诊断指标。抗中性粒细 胞 胞 浆 抗 体 (antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)是针对中性粒细胞和单核细胞胞浆成分的自身抗体,其靶抗原主要有髓过氧化物酶 (myeloperoxidase,MPO) 和蛋白酶3(proteinase-3,PR3)[5]。既往对ANCA 的研究多着重于血管炎、风湿免疫性疾病,近来ANCA 所涉及的疾病范围不断扩大,亦有关于ANCA 在部分弥漫性间质性肺病患者中呈阳性[6-8]的文献报道。笔者前期非对照研究发现BO 患儿血清中ANCA水平异常升高[9],提示ANCA 与BO 可能存在一定的相关性。为进一步探讨ANCA 在BO 中的临床意义,本研究检测了59 例BO 患儿血清中ANCA 的表达水平,并分析其与肺炎患儿及健康儿童的差异,现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究为前瞻性研究,通过广州医科大学附属第一医院伦理委员会批准 (医伦审2014第33号)。选择2009年6月至2014年10月在广州医科大学附属第一医院儿科住院诊断为BO的患儿共59例为BO 组;同期于本科住院的轻症支气管肺炎患儿43例(轻症肺炎组)、重症支气管肺炎患儿18例 (重症肺炎组)以及同期至儿科门诊体检的正常儿童15名 (正常对照组)。BO 组诊断及纳入标准:符合中华医学会儿科学分会呼吸学组儿童BO 诊断标准[10],包括 (1)急性下呼吸道感染或急性肺损伤后6周以上的反复或持续喘息、气促或咳嗽、喘鸣、呼吸困难,对支气管扩张剂无反应;(2)临床表现与X 线胸片轻重不符,临床症状重,X 线胸片多为过度通气;(3)胸部CT 显示马赛克灌注征、支气管壁增厚、支气管扩张、肺不张;(4)肺功能示阻塞性通气功能障碍;(5)排除其他引起喘息的阻塞性疾病,如支气管哮喘、原发性纤毛运动障碍、囊性纤维性变、异物吸入、先天发育异常、肺结核、艾滋病和其他免疫功能缺陷病等。尚需同时满足以下条件:(1)经规范吸入糖皮质激素(雾化吸入布地奈德混悬液0.5～1 mg/次,2～3次/d)治疗3个月无效; (2)经支气管镜行肺组织穿刺活检,排除支气管异物、呼吸道发育畸形、哮喘、自身免疫性疾病等。轻症肺炎组诊断及纳入标准:符合中华医学会儿科学分会呼吸学组2013年儿童社区获得性肺炎的诊断标准[11],并同时满足以下条件。 (1)本次发病时间小于2 周;(2)既往及本次病程中均无喘息; (3)既往无湿疹、过敏性鼻炎等病史,无家族过敏史;(4)既往无早产、机械通气等病史;(5)本次病程中无低氧血症、心力衰竭、需要呼吸机辅助通气等重症肺炎、大叶性肺炎等表现;(6)本次病程中无全身激素使用史。重症肺炎组诊断及纳入标准:符合中华医学会儿科学分会呼吸学组2013年儿童重症肺炎诊断标准[11],包括(1)一般情况差;(2)有拒食或脱水征;(3)有意识障碍;(4)呼吸频率明显增快,婴儿呼吸频率＞70次/min,年长儿呼吸频率＞50次/min;(5)紫绀;(6)呼吸困难 (呻吟、鼻翼煽动、三凹征);(7)肺部浸润范围大,有多肺叶受累或≥2/3的肺受累;(8)有胸腔积液;(9)脉搏血氧饱和度≤92%;(10)有肺外并发症。满足上述任意一条并同时满足以下条件:(1)既往无湿疹、过敏性鼻炎等病史,无家族过敏史;(2)既往无重症肺炎史;(3)既往无使用免疫抑制药物,无结核病史,无风湿免疫性疾病或肿瘤等(如肾病综合征、血液病等)基础疾病病史。正常对照组纳入标准:选自本院儿科门诊健康体检儿童,有以下指标中任何一项者予以剔除。(1)最近4周有呼吸道感染病史及有任何药物使用史;(2)儿童或家族中有慢性呼吸系统疾病史(如慢性支气管炎、慢性咳嗽、哮喘、过敏性鼻炎等);(3)有风湿免疫性疾病、肾脏疾病或慢性消化系统(如克罗恩病)等其他系统疾病病史。4组儿童性别、年龄比较差异均无统计学意义(表1)。

表1 4组儿童的一般资料

1.2 血清ANCA 的检测方法 住院患儿均于住院首日(入院时)及最后一日 (出院时)、正常儿童于体检当天抽取静脉血3 ml,3 000 r/min 离心10 min (离心半径9.4 cm),离心后取上层血清。使用美国宙斯公司的酶联免疫吸附试验试剂盒对血清样本进行MPO-ANCA、PR3-ANCA 抗体检测,操作过程严格按照试剂说明书进行,检测仪器为酶标仪 (美国Thermo 公司)。根据校正品的平均OD450 值即可算出样品的 MPO-ANCA、PR3-ANCA抗体浓度,计算公式为:待测样品浓度= (待测样品OD 值×CV 值)/校正品平均OD值。阳性判定值为≥180 AAU/ml。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。首先进行Kolmogorov-Smirnov正态分布检验,计量参数呈正态分布时数据以±s表示,采用独立样本的t检验进行比较;非正态分布时以中位数及四分位数间距表示,参考值范围以95%CI表示,采用独立样本或配对样本的秩和检验进行比较。计数资料用频数(百分数)表示,四格表资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组血清MPO-ANCA 表达水平的比较 入院时BO 组的MPO-ANCA 的阳性率及滴度水平均明显高于轻症肺炎组、重症肺炎组及正常对照组(P值均＜0.05),而轻症肺炎组、重症肺炎组与正常对照组的MPO-ANCA 阳性率与滴度水平的组间比较差异均无统计学意义。出院时BO 组的MPO-ANCA 的阳性率及滴度水平仍明显高于轻症肺炎组与重症肺炎组 (P值均＜0.05),而轻症肺炎组与重症肺炎组的MPO-ANCA 阳性率与滴度水平的组间比较差异均无统计学意义。BO 组、轻症肺炎组、重症肺炎组患儿入院时与出院时MPO-ANCA阳性率与滴度水平的组内比较差异均无统计学意义。见表2。

表2 4组儿童MPO-ANCA 表达水平

2.2 4组血清PR3-ANCA 表达水平的比较 入院时BO 组的PR3-ANCA 的阳性率及滴度水平均明显高于轻症肺炎组、重症肺炎组及正常对照组(P值均＜0.05),而轻症肺炎组、重症肺炎组与正常对照组的PR3-ANCA 阳性率与滴度水平的组间比较差异均无统计学意义。出院时BO 组的PR3-ANCA 的阳性率及滴度水平仍明显高于轻症肺炎组与重症肺炎组 (P值均＜0.05),而轻症肺炎组与重症肺炎组的PR3-ANCA 阳性率与滴度水平的组间比较差异均无统计学意义。BO 组、轻症肺炎组、重症肺炎组患儿入院时与出院时PR3-ANCA 阳性率与滴度水平的组内比较差异均无统计学意义。见表3。

3 讨论

BO 是一种累及细支气管的慢性阻塞性肺部疾病,1901年有学者首次报道了2例死于进行性呼吸窘 迫 的BO 患 者[12]。1973 年Gosink 等[13]报 道了52例BO 后逐渐引起人们的注意。随着高分辨率CT、支气管镜技术的开展,BO 逐渐为人们所认识,对其关注与重视亦随之提高。然而,BO 的临床表现及实验室检查结果均为非特异性,高分辨率CT 提示的马赛克灌注征仅为累及细支气管的间接征象,许多累及小气道疾病(如支气管扩张、哮喘)均可以有类似的影像学征象;且儿童具有年龄小及配合度、依从性差的特点,肺功能检查结果仅供参考,故目前儿童BO 的诊断手段不多,存在一定的局限性,可致误诊或漏诊,患儿过度诊治或没有得到早期识别而致严重肺损伤才就诊,延误了治疗时机。因此,探索BO 早期诊断与疾病监测的生物标志物对BO 患儿诊断尤为重要。

ANCA 是针对中性粒细胞和单核细胞胞浆成分的自身抗体,被认为是抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎 (anti-neutrophil cytoplasmic antibody associated with vasculitis,AAV)的主要致病因素。在原发性血管炎疾病研究中,ANCA 的滴度水平与疾病的活动性呈正相关,ANCA 被视为AAV 诊断、严重程度以及复发预测的标志物[14-15]。早期的研究发现ANCA 通过激活中性粒细胞释放大量氧自由基及蛋白水解酶,从而损伤血管内皮细胞,导致血管炎的发生[16-17]。近来的文献资料显示,ANCA 在川崎病、溃疡性结肠炎等多种疾病中异常升高[18-19],在肺间质性疾病的患者中亦有报道[6-8],考虑ANCA 可能参与部分肺间质炎症及纤维化形成。

许多慢性肺部疾病的气道炎症 (包括COPD、支气管哮喘、支气管扩张、囊性纤维化等)以中性粒细胞参与为主,气道中性粒细胞的数量与病情的严重程度密切相关。有研究显示,肺移植后发生BO 的患者肺泡灌洗液中的中性粒细胞数目异常增加,而肺移植后未发生BO 的患者肺泡灌洗液中的中性粒细胞数目则未见明显升高[20]。同样地,有研究发现麻疹感染后BO 患者肺泡灌洗液中的中性粒细胞数目亦较正常对照组明显升高[21]。前期研究[9]首次发现了BO 患儿血清ANCA 异常升高,推测在BO 患者中ANCA 通过激活肺部局灶的中性粒细胞,使其释放大量氧自由基及蛋白水解酶,损伤小气道上皮细胞,从而导致小气道上皮脱落坏死,受损的气道上皮异常修复,在机体异常的上皮再生和组织修复过程中,狭窄阻塞气道不断有中性粒细胞浸润,参与了局灶的炎症反应。笔者对此现象继续深入研究,同时更严格了BO 组及对照组患儿的筛选标准,结果再次证实了MPO-ANCA 与PR3-ANCA 在BO 患儿中异常表达并持续升高,而同期住院肺炎患儿无此现象。由此推测,BO 与AAV 等疾病可能有相似的机体免疫异常反应基础,炎症介质及细胞因子的高分泌是触发BO 致病的扳机,刺激后的中性粒细胞达到一定的阈值,可使高滴度ANCA 部分或完全表达,并与之表面抗原结合,介导后续的一系列炎症反应[22]。

在本研究中,BO 组进行全身激素治疗2 周、肺炎组进行普通抗感染治疗后再复查血清ANCA水平,结果显示BO 组患儿 MPO-ANCA 和PR3-ANCA的阳性率在治疗后仍处于高水平,与治疗前相比无明显变化。对此,笔者推测ANCA抗体属于IgG,而IgG 是血清中主要的抗体成分,约占血清总免疫球蛋白的75%。血清中IgG 维持时间长,消失慢,半衰期约为21 d,因此ANCA水平的下降可能需要较长的时间。此外,BO 患儿小气道出现阻塞,反复的炎症和感染相互作用使得肺组织的中性粒细胞长期定植,中性粒细胞膜表面表达的MPO、PR3 抗原可诱导刺激ANCA 的产生。因此,短期的全身糖皮质激素抗炎治疗仍无法降低ANCA 的水平,可能需经长时间治疗,组织得以修复才能减少中性粒细胞的浸润,从而降低ANCA 抗体的水平,故日后仍需对血清中ANCA水平进行长期追踪观察。

表3 4组儿童PR3-ANCA 表达水平

综 上 所 述,MPO-ANCA 及PR3-ANCA 在BO 患儿为高表达并持续较长时间,ANCA 与BO具有一定相关性,提示ANCA 可能参与了BO 的发病过程,患儿血清ANCA 持续阳性可增加BO诊断的可靠性,其作用机制及是否可作为BO 诊断的生物标志物有待进一步的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突