桑树桑黄总三萜提取工艺优化及其降血脂、抗氧化活性研究

何 策，王 超，陈 纯，王婷婷

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江杭州 311300）

桑黄是一种珍贵的食药用菌，这一名称最早在唐朝的《药性论》中出现，但这些时期的“桑黄”与现在所称的有所不同，学者现今将桑黄归类为一个新属，且证实正宗的桑树桑黄生长在桑属的树干上，是一种多年生、木栓质的纤孔菌，名为桑黄纤孔菌（Inonotus sanghuang）[1-2]。早期对桑黄的研究主要集中在火木针层孔菌（P.igniarius）、裂蹄针层孔菌（P.linteus）和鲍氏针层孔菌（P.baumii）上[3]。这些研究表明桑黄具有降血脂、抗氧化、调节免疫和保肝护肝[4]等多种重要生理功能。桑黄含有多种活性成分，熟知的有多糖、黄酮、三萜类、吡喃酮和多酚类等物质，除此之外还有多种酶类[5]。其中三萜类物质的研究是目前非常热门的研究方向[6]，其具有抗肿瘤[7]、抗病毒[8]、抗菌[9]以及消炎镇痛[10]等生物学特性，可以用于多种疾病的研究和临床治疗。

目前三萜类化合物的提取工艺有超声提取、高剪切提取、微波提取和双水相提取等。梁佳等[11]研究了微波法提取桑黄（P.igniarius）总三萜的工艺，得到了微波提取总三萜的最佳条件，但提取率较低，仅有1.48 mg/g。谢江宁等[12]采用正交试验设计优化超声提取桑黄（P.igniarius）总三萜的工艺，得到了一种用时少、提取率高的方法，最终获得了9.40 mg/g的提取率，但由于正交试验的局限性不能很好地反映整个区域上因素的最佳组合。而于小凤等[13]的研究虽然完善了这一点，但是用到的桑黄同为火木针层孔菌（P.igniarius），并非桑黄纤孔菌。研究表明桑树桑黄中总三萜的含量比其他种的桑黄要高出许多[14]，可见其相较其他种的桑黄具有更好的研究价值，但目前对桑树桑黄提取总三萜的工艺及其体外活性的研究还少有报道。

本研究选用超声波法提取桑树桑黄子实体中的三萜类化合物，并在单因素实验的基础上采用响应面法优选最佳方案，并对总三萜进行体外降血脂和抗氧化实验，以期为开发天然有效的降血脂和抗氧化产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑树桑黄子实体 由浙江省农业科学研究院提供；甘氨胆酸钠（批号：Y28F10C81486）、牛磺胆酸钠（批号：L1715127）、胆酸钠（批号：L24F11F108900）、胃蛋白酶（批号：Y27M10J84202）、胰蛋白酶（批号：R11J10D92532）、齐墩果酸（批号：H04J9Z62784）、维生素C（批号：W12J11S115700） 上海源叶生物科技有限公司；考来烯胺散（20141108） 南京厚生药业有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（D9132）、2,2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）（SLBF4684V）、TPTZ（K1319026）Sigma公司；其余试剂 均为分析纯。

UV-5500紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器公司；SC-04离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；HH-4数显恒温振荡器 常州恒德仪器制造有限公司；DS-7510DTH超声清洗机 小美超声仪器有限公司；Nicolet6700傅立叶红外光谱仪 美国ThermoElectron公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑树桑黄总三萜的提取工艺 先将桑树桑黄子实体置于鼓风干燥箱中烘干至恒重，取出后将其粉碎，过40目筛，密封保存于玻璃罐中。称取适量桑黄于锥形瓶中，加入75%的乙醇溶解，振荡均匀后于55 ℃的温度下进行超声辅助提取，固定提取功率为300 W，频率为40 kHz。45 min后取出，在4000 r/min的条件下离心18 min，收集上层清液于旋转蒸发仪中挥去溶剂[15]，最后得到桑树桑黄总三萜提取物。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 料液比对总三萜得率的影响 按照提取温度55 ℃，提取时间45 min，乙醇浓度为75%，分别考察料液比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25（g/mL）时对总三萜得率的影响。

1.2.2.2 提取温度对总三萜得率的影响 按照料液比为1:20 （g/mL），提取时间45 min，乙醇浓度为75%，分别考察提取温度为25、35、45、55、65 ℃时对总三萜得率的影响。

1.2.2.3 提取时间对总三萜得率的影响 按照料液比为1:20 （g/mL），提取温度55 ℃，乙醇浓度为75%，分别考察提取时间为25、35、45、55、65 min时对总三萜得率的影响。

1.2.2.4 乙醇浓度对总三萜得率的影响 按照料液比为1:20 （g/mL），提取时间45 min，提取温度55 ℃，分别考察乙醇浓度为55%、65%、75%、85%、95%时对总三萜得率的影响。

1.2.3 响应面法优化提取工艺 基于单因素实验的结果，分别选择提取时间（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）和料液比（D）为自变量，以总三萜的得率作为响应值，优化总三萜的提取工艺，试验设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of the response surface experiment

1.2.4 总三萜含量的测定

1.2.4.1 齐墩果酸标准曲线的建立 准确称取20 mg的齐墩果酸样品溶解于乙醇中，定容至刻度线得到0.2 mg/mL的标准溶液。吸取标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于7支试管中，水浴蒸干溶剂。向其中加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液（需新鲜配制），再加入0.8 mL高氯酸，振荡均匀，在75 ℃恒温水浴加热18 min后取出快速冷却，加入乙酸乙酯定容至5 mL，在552 nm处测定吸光值[16]。以吸光值为纵坐标，齐墩果酸的含量为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：y=10.161x+0.061，R2=0.9986。

1.2.4.2 总三萜含量的测定 选取20 mg的总三萜提取物于试管中，按照1.2.4.1的方法（香草醛-冰醋酸-高氯酸）测定出吸光值，再根据标准曲线法计算出总三萜的含量。总三萜的得率按下式计算。

式中：W表示总三萜得率，%；c表示根据吸光值计算出的溶液质量浓度，mg/mL；D表示溶液稀释倍数；V表示定容的体积，mL；m表示桑黄的质量，mg。

1.2.5 桑树桑黄总三萜体外降血脂活性试验

1.2.5.1 胆酸盐标准曲线的建立 分别选取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/mL的甘氨胆酸钠2 mL于试管中，加入5 mL质量分数为60%的浓硫酸溶液，在70 ℃的恒温水浴锅下反应20 min，取出后用冰水冷却5 min，在387 nm处测定吸光值[17]。以甘氨胆酸钠含量为横坐标，吸光值为纵坐标建立标准曲线，求得标准曲线线性方程为：y=1.312x+0.1244，R2=0.9969。

牛磺胆酸钠和胆酸钠建立标准曲线的方法同上，求得牛磺胆酸钠的标准曲线线性方程为：y=2.677x-0.0702，R2=0.9954。胆酸钠的标准曲线线性方程为：y=4.013x+0.1287，R2=0.9984。

1.2.5.2 总三萜结合胆酸盐能力的测定 向锥形瓶中分别加入20、40、60、80、100 mg/mL的桑树桑黄总三萜3 mL，接着依次加入10 mg/mL的胃蛋白酶1 mL和10 μmol/mL的盐酸溶液3 mL，在37 ℃的条件下恒温振荡培养1 h。再用10 μmol/mL的氢氧化钠溶液将pH调节至6.4，然后加入配制好的10 mg/mL胰蛋白酶4 mL，在37 ℃的条件下恒温振荡培养1 h。加入1 μmol/mL的胆酸盐4 mL，在37 ℃的条件下恒温振荡培养1 h，将消化物转入离心管，4000 r/min离心18 min，取上清液测定吸光度，根据标准曲线法计算胆酸盐结合量[18]。以80 mg/mL考来烯胺作为阳性对照，评价总三萜对胆酸盐的结合能力。

1.2.6 桑树桑黄总三萜体外抗氧化活性试验

1.2.6.1 对DPPH自由基清除能力的测定 参考Heleno等[19]的方法，首先制备0.02 mmol/L的DPPH乙醇溶液，分别吸取2 mL于不同的试管中，向其中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1、1.5 mg/mL的总三萜梯度溶液2 mL，混匀，在暗室内常温反应0.5 h，然后在517 nm处测定其吸光值。以总三萜的乙醇溶液作为空白组，DPPH的乙醇溶液作为对照组，以VC作为阳性对照品，根据下式计算DPPH自由基清除率：

式中：Ao表示对照组的吸光值；As表示总三萜与DPPH溶液的吸光值；A1表示空白组的吸光值。

1.2.6.2 对ABTS自由基清除能力的测定 参考Singh等[20]的方法制备ABTS工作液：取7 mmol/L的ABTS水溶液0.5 mL和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液0.5 mL，混匀，在暗室内反应15 h，得到ABTS母液。将ABTS母液用磷酸缓冲液稀释至其在734 nm处的吸光值为0.7±0.1，即得ABTS工作液。

配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1、1.5 mg/mL的总三萜梯度溶液加入到ABTS工作液中，混匀后在734 nm处测定吸光值。以磷酸缓冲液与总三萜的吸光值作为空白组吸光值，蒸馏水与ABTS的吸光值作为对照组吸光值。以VC作为阳性对照品，根据下式计算ABTS自由基清除率：

式中：Ao表示对照组的吸光值；As表示总三萜与ABTS溶液的吸光值；A1表示空白组的吸光值。

1.2.6.3 铁离子还原法测定 参考Benzie等[21]的方法用10 mmol/L的TPTZ、0.3 mol/L的乙酸和20 mmol/L的三氯化铁溶液以1:10:1的体积比制备FRAP溶液。

建立硫酸亚铁标准曲线[22]：分别选取0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 mmol/L的硫酸亚铁标准溶液0.08 mL于试管中，加入4 mL的FRAP溶液，混合均匀后置于37 ℃的恒温水浴中反应10 min，在593 nm处测定其吸光值，以硫酸亚铁的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到的标准曲线方程为：y=0.267x-0.0266，R2=0.9919。

精确吸取0.5、1、2、3、4 mg/mL的总三萜溶液于试管中，加入2.5 mL的FRAP溶液，振荡均匀后在37 ℃的水浴锅中反应10 min，于593 nm处测定吸光度值。分别以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的VC作为阳性对照品，各物质的抗氧化值以FRAP值表示：以标准曲线法计算出硫酸亚铁的浓度即为FRAP值[23]。

1.3 数据处理

试验数据使用SPSS 21.0软件进行统计学分析，试验图表均采用Origin 2017软件进行绘制，响应面试验使用Design-Expert 8.0.6进行实验设计和数据分析，每组试验均重复3次，试验结果以平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对总三萜得率的影响 由图1可知，在料液比为1:5～1:20（g/mL）时，总三萜的得率随着料液比的增大而增大，这是因为适当高浓度的料液比加快了传质过程[24]。但当料液比超过1:20 （g/mL）时，总三萜的得率反而下降，由于乙醇的体积过少使得与溶剂的接触面积减小，受到的超声波作用也减少，使得总三萜得率下降，所以选择料液比为1:20（g/mL）。

图1 料液比对总三萜得率的影响Fig.1 Effect of solvent-to-solid ratio on extraction of total triterpenoids

2.1.2 提取时间对总三萜得率的影响 如图2所示，总三萜的得率随超声时间的延长呈现先升高再降低的趋势，当时间为45 min时达到最大值。分析其原因，超声波形成大量空化气泡，增加了溶剂与溶质之间的传质和相互作用[15]。但当超声时间逐渐延长时，长时间的加热会使三萜物质的结构遭到破坏，影响了提取效率[25]。因此45 min的提取时间为最佳选择。

图2 提取时间对总三萜得率的影响Fig.2 Effect of reaction time on extraction of total triterpenoids

2.1.3 提取温度对总三萜得率的影响 图3表明，温度为25～55 ℃时总三萜的得率在逐渐递增，但温度在55～65 ℃区间时，总三萜得率反而下降。其原因是当温度适当升高时，可以加快物质分子之间的运动速度，使总三萜化合物之间传导性增加，溶质可以充分溶解在其中。但当温度过高时可能会使桑黄总三萜的结构遭到破坏、氧化、分解[26-27]，因此选择55 ℃为最佳提取温度。

2.1.4 乙醇浓度对总三萜得率的影响 乙醇浓度为55%～75%时，总三萜的得率虽然没有大幅度的增加，但当浓度超过75%时，总三萜的得率开始下降。可能是因为当乙醇浓度过大时，其他醇溶性杂质溶出，导致三萜类组分的溶出量相对减少[28]，因此选择乙醇浓度75%为最佳提取浓度。

图3 提取温度对总三萜得率的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on extraction of total triterpenoids

图4 乙醇浓度对总三萜得率的影响Fig.4 Effect of reaction ethanol concentration on extraction of total triterpenoids

2.2 响应面法优化

2.2.1 响应面模型建立与结果 应用Design-Expert软件对实验结果进行多元回归拟合分析，试验结果见表2，得到桑树桑黄总三萜得率与超声提取各因素变量间的二次方程模型为 Y=11.94+0.45A+0.28B+0.5C+0.37D+0.24AB+0.18AC+0.28AD+0.38BC-0.13BD+0.33CD-0.94A2-0.6B2-0.74C2-0.68D2。

由表3可知，此模型P＜0.0001，说明该回归模型的差异性极显著，配合失拟项的值0.1771＞0.05，这表明在上述区间内整个模型拟合度佳；该模型的R2=0.9686，表面该模型的线性关系显著，调整后的Radj2=0.9372，表明模型可以解释93.72%的响应变异性。

从试验的方差分析中得出方程中的A、B、C、D项对总三萜的得率影响均极显著（P＜0.01），其中C项F值最大，说明对总三萜得率影响较大的因素是提取温度，即各因素对试验结果的影响程度分别是：提取温度＞提取时间＞料液比＞乙醇浓度，因此在试验中应严格控制提取温度。在交互项中，AC与BD的交互作用不显著（P＞0.05），AB与AD的交互作用显著（P＜0.05），BC与CD的交互作用极显著（P＜0.01）。由此可得，乙醇浓度与提取温度、提取温度与料液比两两因素之间的交互作用对总三萜得率的影响较大。二次项A2、B2、C2、D2影响均极显著（P＜0.01）。

响应面图能较为直观地反映出各因素间交互作用对响应值的影响，曲面越陡峭、倾斜程度越高说明影响越大[29]。由图5可知，AB、AD、BC、CD的曲面较为陡峭，说明这些因素之间的交互作用显著，而AC与BD的曲面弯曲程度较小，表明交互作用不显著，这与方差分析的结果基本一致。

表2 响应面设计与试验结果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 最优提取条件 对模型进行最优工艺的分析，得到最佳提取条件为：提取时间49.35 min、乙醇浓度79.66%、提取温度61.22 ℃，料液比为1:22.35（g/mL），预测桑树桑黄总三萜的最高得率可达到12.35%。为了便于操作，将此四因素的水平分别调整为提取时间49 min、乙醇浓度为80%、提取温度为61 ℃，料液比为1:22 （g/mL）。调整后的验证试验表明，总三萜得率可达12.32%±0.17%，非常接近预测值，表明此模型可以用于分析桑树桑黄总三萜提取工艺的优化。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variances

2.3 桑树桑黄总三萜体外结合胆酸盐研究结果

2.3.1 桑树桑黄总三萜对胆酸盐的结合量 桑树桑黄总三萜与胆酸盐的结合能力如图6所示，在特定范围内，总三萜的质量浓度与胆酸盐的结合量呈正相关，当质量浓度为20～60 mg/mL时，总三萜对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠和胆酸钠的结合量均显著性升高（P＜0.05），在质量浓度为80～100 mg/mL时，总三萜与胆酸盐的结合接近饱和状态，其与牛磺胆酸钠、胆酸钠的结合量无显著性变化（P＞0.05），对甘氨胆酸钠的结合量显著下降（P＜0.05）。在质量浓度为80 mg/mL时对胆酸盐的结合量最大。

2.3.2 桑树桑黄总三萜的体外降血脂活性 考来烯胺（Colestyramine）是一种常见的降血脂药物，主要作用于体内的胆酸或胆固醇，能有效改善高血脂症患者的血脂水平，具有较好的临床疗效[30]。实验以80 mg/mL考来烯胺结合胆酸盐的能力作为对照[31]，测定同质量浓度下桑树桑黄总三萜与胆酸盐的结合量，并将结果作为数值比率进行比较。结果如表4所示，总三萜对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠和胆酸钠的结合能力相当于同剂量考来烯胺的50.93%、52.14%和43.06%，说明桑树桑黄总三萜具有较好的结合胆酸盐的能力。胆酸盐被结合后含量减少，会促使肝脏中的胆固醇降解生成胆酸盐以维持动态平衡，从而使胆固醇降低达到降血脂的目的[17]。因此可以表明桑树桑黄总三萜具有良好的体外降血脂活性。

图5 各因素交互作用的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction of various factors

图6 桑树桑黄总三萜对胆酸盐的结合量Fig.6 The binding amount of total triterpenoids to cholic acid salt in Inonotue sanghuang

2.4 桑树桑黄总三萜体外抗氧化结果

2.4.1 清除DPPH自由基的能力 VC和桑树桑黄总三萜对DPPH自由基的清除能力如图7所示，在试验范围内，两种物质的质量浓度越大，清除率越高。当VC的质量浓度达到1.0 mg/mL时，其清除作用逐渐平稳，但总体的清除能力均大于桑树桑黄总三萜。在质量浓度为0.1～1.5 mg/mL范围内，桑树桑黄总三萜清除DPPH自由基的IC50为0.304 mg/mL，VC的IC50为0.060 mg/mL。当质量浓度达到1.5 mg/mL时，总三萜的清除作用达到了86.45%±2.16%，相当于同质量浓度VC的93%，证明桑树桑黄总三萜具有良好的清除DPPH自由基的能力。

2.4.2 清除ABTS自由基的能力 VC和桑树桑黄总三萜对ABTS自由基的清除能力如图8所示，在试验范围内，两种物质呈现出良好的剂量-效应关系，但VC的清除能力总体大于总三萜。根据线性回归方程分析，总三萜清除ABTS的自由基的IC50值为0.520 mg/mL，VC的IC50为0.197 mg/mL。当质量浓度为1.5 mg/mL时，总三萜的清除作用达到了80.34%±2.21%，相当于同质量浓度VC的87%，证明桑树桑黄总三萜具有良好的清除ABTS自由基的能力。

表4 桑树桑黄总三萜对胆酸盐的结合能力Table 4 The binding capacity of total triterpenoids from Inonotus sanghuang to bile salts in vitro

图7 桑树桑黄总三萜的DPPH自由基清除能力Fig.7 DPPH free radical scavenging ability of total triterpenoids from Inonotus sanghuang

图8 桑树桑黄总三萜的ABTS自由基清除能力Fig.8 ABTS free radical scavenging ability of total triterpenoids from Inonotus sanghuang

2.4.3 铁离子的还原能力 Fe3+-TPTZ在抗氧化物质的作用下时会转变成Fe2+-TPTZ，溶液的颜色也会由黄绿色变成蓝色，在597 nm处有最大吸光值[32]。当质量浓度为0.5 mg/mL时，VC和总三萜的的FRAP值分别为8.01和2.49 mmol/L，VC的还原能力大于总三萜。但当总三萜的质量浓度为4.0 mg/mL时，其FRAP值可达7.54 mmol/L。由此可见桑树桑黄总三萜的还原能力虽小于VC，但当达到足够大的质量浓度时，其还原能力也会提高。

3 结论

选用超声波法提取桑树桑黄子实体中的三萜类化合物，在单因素试实验的基础上采用响应面法优化了提取桑树桑黄总三萜的工艺，结果表明，提取时间49 min、乙醇浓度为80%、提取温度为61 ℃，料液比为1:22 （g/mL），总三萜得率可达12.32%±0.17%，与模型预测值非常接近，说明此工艺参数可行，且总三萜的得率高于之前的研究结果[11-13]。

桑树桑黄总三萜具有较好的体外降血脂活性，且在一定范围内，总三萜的质量浓度越大结合胆酸盐的能力越强，在质量浓度为80 mg/mL时结合量最大。其体外结合甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、胆酸钠的能力为同等剂量考来烯胺的50.93%、52.14%和43.06%。桑树桑黄总三萜还具有较好的还原能力和抗氧化活性，其清除DPPH和ABTS自由基的IC50值分别为0.304和0.520 mg/mL，其FRAP值可达7.54 mmol/L，虽然低于阳性对照品VC，但具有一定的参考价值。

图9 VC和桑树桑黄总三萜的还原能力Fig.9 The reduction capacity of VC and total triterpenoids from Inonotus sanghuang

本文对桑树桑黄的降血脂和抗氧化活性进行了初步的探索，为开发桑树桑黄提供了一定的理论参考。但桑树桑黄生长周期长，数量少，对其有效组分的分离纯化亟待进一步探讨，以提高利用率；且桑树桑黄总三萜成分复杂，对其构效关系及体内降血脂抗氧化活性也需要进行深入研究。