乙酸钠对小鼠摄食及摄食相关基因表达的影响

王云云，段 颖，候咏微，曾涵芳，韩兆玉

(南京农业大学 动物科技学院,江苏 南京 210095)

机体内起主要生理作用的短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是由肠道内厌氧微生物发酵难消化的碳水化合物而产生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。SCFAs不仅对肠上皮细胞的生长、分化、代谢和转运产生影响，而且对宿主的营养代谢、免疫抗病、调节肠道电解质及微生物平衡等方面有着重要的调控作用[1-2]。研究表明，在消化道内未降解的营养素经微生物发酵产生的SCFAs，可刺激胃肠上皮的内分泌细胞产生胃肠激素，其作用于中枢神经系统的脑-肠轴来调控食欲[3-4]。此外，SCFAs还具有胰岛素样效应，如乙酸可通过血脑屏障刺激中枢神经系统中厌食神经肽基因的表达，从而调控动物食欲[5-7]。因此，探究SCFAs及脂肪酸盐对动物摄食及胃肠激素分泌调控机制的影响，对生产具有重要的指导意义。

采食量是动物生长发育的首要限制因素[8]，受到多种神经递质和激素的影响，如神经肽(neuropeptide,NPY)、胃饥饿素(ghrelin)、胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)、瘦素(leptin,LEP)等，上述物质除ghrelin具有促进摄食作用外，其他激素均为厌食激素[9-10]。不同脂肪酸对畜禽采食量的影响结果各异，其中的机制现阶段尚不完善[11]。研究表明，腹部皮下注射乙酸钠可显著降低家兔日采食量，且对家兔的组织脂代谢产生影响[12]。此外，静脉灌注低浓度(1 mol/L)和高浓度(2 mol/L)乙酸钠对水牛采食量具有显著影响，且胰岛素水平均显著地高于对照组[13]。另外，研究发现在对新生犊牛静脉灌注丙酸钠和乙酸钠时，血糖和血浆胰岛素浓度在灌注丙酸钠15 min后显著升高，而乙酸钠灌注组则无显著性影响[14]。此外，研究表明，JAK2(janus kinase 2)/ STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)信号通路是一条可由细胞因子激活，促使信号从细胞外转移至细胞核的信号传导通路，其失调可导致机体能量稳态的崩溃[15-16]。目前，已知的细胞因子，如LEP、生长激素(growth hormone,GH)、催乳素(prolactin，PRL)等在与相应配体结合后可连接胞内JAK，激活JAK2/STAT3信号通路，进入细胞核。因此JAK2/STAT3通路的激活可降低动物采食量，反之采食量则增加[17]。然而，乙酸钠对小鼠摄食的影响及其对小鼠激素水平的影响和调控机制仍是未知的，需进一步研究。

鉴于此，本试验探讨不同质量浓度的乙酸钠对小鼠摄食及摄食调控因子的影响，以期为研究乙酸盐对摄食调控的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选用60只4周龄体质量为(27.5±2.5) g的SPF级健康昆明小鼠，打好耳标后于标准SPF级鼠房中预饲24 h以缓解应激反应。预饲期结束后，将小鼠随机分为3组，分别为对照组、试验Ⅰ组(低浓度组)及试验Ⅱ组(高浓度组)，每组20只。试验期间每日8：00进行小鼠腹腔注射，对照组注射生理盐水，试验组分别注射0.3,0.5 kg/L的乙酸钠溶液。每7 d进行1次体质量统计，试验期共28 d。试验期间小鼠自由饮食，自由饮水。

1.2 样品采集在试验7,14,21,28 d时每组随机取5只小鼠分别进行活体眼部采血1 mL，离心分离血清，-80℃保存待测。采集小鼠结肠、十二指肠、肝脏等组织，用PBS浸洗后，将其分为两部分，一部分保存于液氮中用于qRT-PCR检测，另一部分置于4%多聚甲醛中固定用于组织切片制作与观察。

1.3 组织切片观察将固定于4%多聚甲醛中的肠组织和肝脏组织样品制作石蜡切片，进行HE染色，最后通过光学显微镜观察组织的形态学变化。

1.4 血清生化指标的检测测定NPY及LEP血清生化指标。以上指标由酶标仪测得，酶联免疫试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.5 总RNA提取与RT-qPCR测定相关基因的表达将从各组小鼠中提取的结肠及十二指肠组织置于无菌罩内消化3～5 min，按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA。取1 000 ng总RNA用TaKaRa试剂盒进行反转录成cDNA，-80℃保存备用。按照SYBR Green 试剂盒检测RNA的表达水平，反应产物经溶解曲线检测特异性。用2-△△Ct法计算各基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物信息

2 结果

2.1 乙酸钠对小鼠采食量、体质量及饲料转化率的影响由图1可知，注射乙酸钠后3组小鼠采食量总体呈下降趋势，且试验Ⅱ组更为明显，但差异不显著(P>0.05)。由表2可知，注射乙酸钠对小鼠体质量在时间和浓度上具有交互作用(P<0.05)。试验组体质量在21 d前均高于对照组，且试验Ⅱ组在7 d时显著高于对照组(P<0.05)，21 d后，试验组体质量均低于对照组，且21 d时试验Ⅰ组显著低于对照组(P<0.05)。此外，体质量水平显著受饲养时间影响(P<0.001)，可见对照组在21 d后体质量显著升高，而试验Ⅱ组在14 d后显著升高(P<0.05)。由图2可知，乙酸钠使小鼠饲料转化率呈现出先高后低的趋势，且各组皆在14 d达到饲料转化率峰值；除14 d外，试验组饲料转化率皆低于对照组，且试验Ⅱ组更明显。因此，注射乙酸钠总体降低了小鼠采食量和饲料转化率。

注：采食量范围为6.0～8.0 g/(只·d)。CON.对照组；Treatment Ⅰ.低浓度组；Treatment Ⅱ.高浓度组。下同

注：饲料转化率(FCR)=增加的活体质量(g)/消耗的饲料量(g)

表2 乙酸钠对小鼠体质量的影响 g/只

2.2 乙酸钠对小鼠肠道、肝脏组织形态的影响由表3可知，乙酸钠对小鼠小肠绒毛发育在时间和浓度上有交互作用(P<0.001)。相较于对照组，乙酸钠在7,14,21,28 d时对小肠绒毛长度的影响呈先升高后降低再升高的趋势。此外，小肠绒毛发育状况显著受饲养时间的影响(P<0.001)，试验Ⅱ组在7 d时小肠绒毛长度显著低于对照组(P<0.05)，在14,28 d时显著高于对照组(P<0.05)。由图3可知，乙酸钠处理下的肝脏组织表观发育状况正常。因此，乙酸钠在7 d时对小肠绒毛发育起到抑制作用，而14，28 d时起到促进作用，且在试验Ⅱ组中更为显著。

图3 乙酸钠对小肠绒毛(左)及肝脏(右)发育状况的影响

表3 乙酸钠对肝脏组织发育情况的影响 μm

2.3 乙酸钠对小鼠血清NPY及LEP的影响由表4所示，乙酸钠对小鼠血清摄食因子NPY在时间和浓度上没有互作效应(P>0.05)。7 d时，相较于对照组，试验Ⅱ组NPY含量显著高于对照组(P<0.05)。此外，乙酸钠对血清LEP在时间和浓度上有互作效应(P<0.05)。其中试验Ⅰ组在14，21，28 d时LEP含量显著低于7 d (P<0.05)，其他均无统计学差异。

表4 乙酸钠对小鼠血清NPY及LEP含量影响 ng/L

2.4 乙酸钠对小鼠结肠摄食相关基因mRNA表达的影响如图4所示，乙酸钠对小鼠结肠3种摄食相关基因PYY、CCK、LEP、JAK2及STAT3的mRNA相对表达量在时间和浓度上均有互作效应(P<0.001)。在试验各个时期，试验Ⅰ组各mRNA表达量持续高于对照组和试验Ⅱ组。如图4A所示，试验Ⅰ组PYY表达量在7 d时显著高于对照组(P<0.05)，试验Ⅱ组在14，28 d时显著高于对照组(P<0.05)。如图4B所示，试验Ⅰ组CCK表达量在14，21 d时显著高于对照组(P<0.05)，试验Ⅱ组在14，28 d时显著低于对照组(P<0.05)。如图4C所示，试验Ⅰ组LEP表达量在7，14 d时显著高于对照组(P<0.05)。如图4D～E所示，试验Ⅰ组JAK2和STAT3表达量在7，14，21 d时皆高于对照组(P<0.05)，试验Ⅱ组JAK2和STAT3表达量在7，14 d时显著低于对照组但在21 d时显著高于对照组(P<0.05)。因此，除试验Ⅱ组在14 d左右时抑制了摄食调控因子CCK及JAK2、STAT3的mRNA表达外，乙酸钠在4周内总体上促进了结肠中具有抑制摄食作用的相关基因表达来抑制摄食，且在7，14，21 d时的试验Ⅰ组中作用更为显著。

图4 乙酸钠对小鼠结肠摄食因子PYY(A)、CCK(B)、LEP(C)、JAK2(D)和STAT3(E)基因mRNA表达的影响

2.5 乙酸钠对小鼠十二指肠摄食相关基因mRNA表达的影响如图5所示，乙酸钠对小鼠十二指肠摄食因子PYY、CCK、LEP、JAK2及STAT3的mRNA表达量在时间和浓度中均有互作效应(P<0.01)。在试验各个时期，试验Ⅰ组的各mRNA表达量在4周内均高于对照组和试验Ⅱ组。如图5A所示，试验Ⅰ组的PYY表达量在7 d时显著高于对照组(P<0.05)。如图5B所示，试验Ⅰ组的CCK表达量在21 d时显著高于对照组(P<0.05)。如图5C所示，试验Ⅰ组的LEP表达量在7，14，21 d时均显著高于对照组(P<0.05)。如图5D、E所示，相较于对照组，乙酸钠处理在7 d时均显著促进了JAK2和STAT3表达(P<0.05)；而14 d时试验Ⅱ组显著降低了JAK2和STAT3的表达(P<0.05)。因此，除试验Ⅱ组在14 d时抑制了JAK2和STAT3的mRNA表达外，乙酸钠在4周内总体上促进了十二指肠中具有抑制摄食作用的相关基因表达来抑制摄食,且在7，14，21 d时的试验Ⅰ组中作用更为显著。

图5 乙酸钠对小鼠十二指肠摄食因子PYY(A)、CCK(B)、LEP(C)、JAK2(D)及STAT3(E)基因mRNA表达的影响

3 讨论

乙酸可由不易被消化的碳水化合物经肠道微生物菌群发酵产生[18]。在哺乳动物中，乙酸可直接通过血脑屏障进而影响动物食欲[19]。有研究表明[20]，动物的采食受大脑神经信号的调节，如外周信号和下丘脑食欲中枢网络。其中外周信号主要包括来自胃、肠道及血液中的激素及营养代谢物等；而下丘脑食欲中枢的调节主要指一些外周信号和食欲调节肽等通过刺激下丘脑食欲中枢而产生的一种采食调控行为[14]。GOSWAMI等[21]和FROST等[9]的研究表明，对小鼠腹腔注射500 mg/kg乙酸盐后1，2 h发现，其采食量显著降低；刘宇[22]在饲粮中添加0.15%的乙酸钠发现，其可显著增加斑马鱼的增重率和饲料转化率。本试验结果显示，除高质量浓度乙酸钠(0.5 kg/L)注射在14 d时提高了小鼠饲料转化率及肠绒毛长度外，乙酸钠在4周内总体上抑制了小鼠的采食量、增重率、饲料转化率及肠绒毛发育程度，故在一定程度上证明乙酸钠可对动物的采食情况产生影响。

脑-肠肽是一类在胃肠道等外周组织及中枢神经系统中广泛分布的肽类激素，与胃肠道发挥双向调节作用，并进一步调节生理稳态及摄食等活动[23]。先前研究表明，胃肠上皮细胞分泌的胃肠激素，如具有促进摄食效果的ghrelin及厌食效果的PYY、CCK、胰多肽(pancreatic polypeptide,PP)、胰高血糖素-1(GLP-1)等，皆可参与调节多种摄食相关的活动。CCK主要由十二指肠和空肠分泌；PYY主要由结肠、直肠分泌，两者皆在外周组织发挥调节胃肠功能的作用[24]。此外，动物摄食后，营养物质进入胃肠道从而刺激脑-肠肽的释放，通过迷走传入神经元将信号传递给中枢神经系统，神经中枢将信号整合后经传出神经到达效应器官，以促进或抑制摄食；脑-肠轴系统能充分感应机体的营养状况，同时释放的脑-肠肽及相关神经递质共同参与对食物摄取的调节，以维持机体的能量稳态；其既是将大脑中枢神经系统和胃肠道联系起来的神经内分泌网络，也是中枢神经系统(CNS)与肠神经系统(ENS)之间的双向整合系统[25-26]。本试验结果显示，乙酸钠处理在4周内总体上促进了结肠及十二指肠中厌食激素基因PYY、LEP、CCK的mRNA表达，尤其是低质量浓度乙酸钠(0.3 kg/L)在7，14，21 d时显著促进了结肠中此3种厌食激素的mRNA表达，表明乙酸钠在一定程度上影响了胃肠激素的分泌活动。

摄食调控的机制是一个复杂的生理生化过程，对动物摄食行为和能量稳态的调节受到传入到大脑中的各种反映营养状态和外部环境信号的共同影响[25]。下丘脑是主要的调节摄食和能量稳态的中枢神经系统，下丘脑弓状核(arcuate nucleus,ARC)作为关键的摄食调控核团，通过接受外周神经和胃肠激素的刺激信号参与对摄食的调节[27]。JAK2/STAT3信号通路是一条由细胞因子激活的、使信号快速从细胞外转移至细胞核的信号传导通路，可使带酪氨酸的蛋白活化，引发基因和蛋白质水平的变化，在机体中普遍存在，在摄食和能量平衡的调节中占有重要地位[28]。LEP转导型JAK2/STAT3信号通路是现阶段普遍接受的摄食调控通路，其机理主要为LEP通过血脑屏障与下丘脑弓状核的受体结合后，激活JAK2-STAT3通路，STAT3进入细胞核通过抑制神经肽Y/刺鼠相关蛋白(AgRP/NPY)神经元及刺激阿黑皮素原(POMC)神经元，从而共同发挥抑制摄食作用[29-30]。本试验结果显示，除高质量浓度乙酸钠(0.5 kg/L)在14 d左右显著抑制了结肠及十二指肠的JAK2和STAT3的mRNA表达外，乙酸钠在4周内总体上促进了肠道JAK2及STAT3的mRNA表达，且在7，14，21 d时的结肠中表现更为显著，表明乙酸钠在一定程度上影响了肠道中的JAK2/STAT3通路状态。

综上所述，腹腔注射乙酸钠溶液在一定程度上影响了小鼠的摄食活动。相较于对照组，低质量浓度乙酸钠(0.3 kg/L)通过降低4周内采食量和饲料转化率及显著上调7，14，21 d时肠道3种厌食激素CCK、LEP、PYY 和摄食调控因子JAK2、STAT3的mRNA表达来抑制摄食；高质量浓度乙酸钠(0.5 kg/L)除在14 d 左右通过促进肠绒毛发育、提高饲料转化率及显著下调肠道JAK2和STAT3的mRNA表达来短暂的促进摄食外，其在4周内整体上也抑制了小鼠的摄食活动。