凤仙花花青素苷的超声辅助提取工艺及其抗氧化研究

蔡 珊，纪 朴，张卓尔，张易华，黄亚梅，曹澳华，杨 芳

(1.安康学院 现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000;2.陕西安康中学,陕西 安康 725000;浙江农林大学 理学院,浙江 杭州 311300)

凤仙花(Impatiensbalsamina.L)，俗称指甲花，为凤仙花科、凤仙花属，一年生草本花卉，花形似蝴蝶，花色多，自播繁殖[1]，生存力强，适应性好，一般很少有病虫害，且凤仙花具有祛风除湿、活血定痛、抗菌、抗氧化防止蛋白损伤[2]等功效，故而在诸多方面有较大的应用价值。

花青素(anthocyanin)又称花色素、花色苷，为酚类化合物中类黄酮物质，普遍存在于植物花瓣、果实等部位，是一类水溶性色素[3]，以C6-C3-C6为基本结构骨架。因其结构中的酚羟基，花青素苷具有一定的抗氧化活性：吕婉婉等[4]、郭丽等[5]、曹柏营等[6]、杭园园等[7]、Sharma. G[8]研究表明花青素苷对自由基具有较高的清除能力，且王彦平等[9]、葛艳林[10]、李玲等[11]研究发现花青素苷对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基、OH自由基的清除能力均高于维生素C。花青素苷除抗氧化外还具有诸多生理功能：Erlei Wang[12]. Ashley M. Mudd[13]. Faeeukh Aqil[14]. Lilliana Primo da Silva[15]. Radha Munagala[16].研究表明花青素苷能够抑制细胞增殖进而抑制癌细胞生长并引发细胞凋亡；Jonfeng LI. Sharma. G[17]、邓红梅等[18]、孙倩怡等[19]、胡能兵[20]等研究表明花青素苷有着良好的抗炎抑菌效果；Bushra Hasan Khan[21]研究发现花青素苷对四氯化碳诱导的大鼠肝损伤具有一定的保护作用；Yoon-Mi Lee[22]研究发现花青素苷对肥胖诱导的代谢紊乱和炎症有益。随着科技的发展，花青素苷在医药、保健品等行业有着巨大的发展空间，故而对花青素苷的需求量也日益增大。

花青素苷的提取方法主要有两大类，一类为传统提取法，即有机溶剂浸提；另一类是在传统提取法的基础上增加超声、微波、超临界等方法辅助，以增加提取率。笔者实验以超声辅助法对凤仙花花青素苷进行提取，以单因素实验、正交试验优化提取方案，并通过大孔吸附树脂纯化，以DPPH自由基清除率、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐{2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt， ABTS}自由基清除率以及还原力测定(铁氰化钾法)为指标，对比凤仙花花青素苷与维生素C的抗氧化性，为今后凤仙花花青素苷的进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

Sonicator4000超声波破碎仪(美国QSonica公司)；V-1100D型可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；H-1850R高速台式冷冻离心机(上海利鑫坚离心机有限公司)；DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 超声辅助法提取凤仙花花青素苷 准确称取凤仙花花粉1.0000 g于烧杯中，分别以超声频率(90、92、95、97、100Hz)、乙醇浓度(55%、60%、65%、70%、75%)、超声温度(35、37、40、43、45℃)为实验条件，pH=1的乙醇溶液为提取剂，超声提取30 min(料液比为1∶20)，6 000 r·min-1离心10min，取上清液测OD530，每组实验设置3个平行重复；根据单因素实验结果进行正交试验。

1.3.2 凤仙花花青素苷提取率的计算 花青素苷提取率(mg·g-1)=A*V*M*DF/(ε*d*m)[20]A为530 nm处测得的吸光度，V为提取液体积，DF为稀释倍数，d为光路直径，M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量455.2，m为品质量，ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数29600[20]。(绝大多数花青素苷中以矢车菊素-3-葡萄糖苷为主，故以矢车菊素-3-葡萄糖苷为对象计算。)

1.3.3 凤仙花花青素苷的分离纯化 大孔树脂的活化、筛选：大孔吸附树脂的预处理见杭园园等[7]。筛选方法见李健等[23]，吸附率(%)=[A530nm(前)-A530nm(后)]/A530nm(前)×100，计算解吸率(%)=A530(解析)/A530(前)×100。比较选择进行动态吸附试验，分析大孔树脂的选择结果。

柱层析法纯化花青素苷：称取最佳树脂100 g，预处理后装柱。将提取液过该树脂柱，花青素苷被吸附在树脂上，待树脂饱和后用蒸馏水冲洗，再用无水乙醇洗脱，收集洗脱液，测定吸光度。

1.3.4 凤仙花花青素苷抗氧化活性试验 DPPH自由基清除率的测定：具体操作见王彦平等[9]。

ABTS自由基清除率测定：具体操作见慈美琳等[24]。

还原力测定(铁氰化钾法)：具体操作方法见慈美琳等[24]。

习近平在庆祝中国共产党成立95周年大会上指出：“在5000多年文明发展中孕育的中华优秀传统文化，在党和人民伟大斗争中孕育的革命文化和社会主义先进文化，积淀着中华民族最深层的精神追求，代表着中华民族独特的精神标识。”[1]因而可以说，由中华优秀传统文化、革命文化、社会主义先进文化构成的中国特色社会主义社会主义文化，就是中华民族的文化。中国特色社会主义文化自信，就是中华民族的文化自信，本质上就是中华民族的民族自信。

1.4 数据处理

采用 Excel 2010、spss19.0软件处理数据和作图，极差分析法对正交试验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 超声辅助法提取凤仙花花青素苷

2.1.1 单因素结果分析 由图1所得，随着超声频率增大，花青素苷提取率逐渐升高，当超声频率为100Hz时提取率最高。但在超声频率为95Hz时，提取率有所下降。可能因为超声波处理过程中空化泡沫剧烈压缩和崩溃的瞬间，产生的热氧化效应造成花青素苷的损失，也可能是因为随着超声波的增加，与蛋白质等结合的花青素苷被提取出来，当超声波热氧化效应大于花青素苷提取率时，会显示为花青素苷的提取了降低，而在缔合的花青素苷提取率高于超声波热氧化效应时，花青素苷的提取率又会升高[25]。

图1 超声频率对凤仙花花青素苷提取率影响

由图2可知，随乙醇浓度的升高，花青素苷提取率逐渐增加，乙醇浓度达到70%时，花青素苷的提取率最高，随后有略微下降趋势，原因是花青素苷不稳定，随着乙醇浓度的增加，可能导致花青素苷结构改变，降低花青素苷提取率[26]。

由图3可知，随提取温度逐渐升高，花青素苷提取率逐渐增大，在43℃时达到最大，而后下降，分析其原因可能是花青素苷性质不稳定，高温破坏花青素苷的结构，使花青素苷发生降解，提取率降低[27,28]。

图2 乙醇浓度对凤仙花花青素苷提取率影响

图3 提取温度对凤仙花花青素苷提取率影响

2.1.2 正交结果分析 正交试验因素水平见表1，由表2、表3可知，各因素对花青素苷提取率影响大小为超声频率>乙醇浓度>提取温度，且超声频率、乙醇浓度、提取温度对花青素苷提率影响均为极显著，优化后的因素条件为超声频率100 Hz、乙醇浓度74%、提取温度43℃。由于优化后的因素条件不在表内，需要进行验证，验证结果为5.403 9±0.330 8 mg·g-1，符合理论结果。

表1 正交试验因素水平

表2 正交实验结果及极差分析

表3 正交试验结果的方差分析

2.2 凤仙花花青素苷的分离纯化

如图4所示为静态吸附下，大孔树脂对凤仙花花青素苷的吸附率与解析率的绘制曲线。(纯化方法见1.3.3)相同条件下，NKA-II的吸附率最高，但解析率最低。HPD-400与ADS-7的解析率近似，ADS-7的吸附率显然高于HPD-400，故选用ADS-7进行花青素苷粗提液的纯化，纯化后的花青素苷浓度为4.4096 mg·g-1。

图4 74%乙醇、超声波辅助提取的花青素苷粗提液

2.3 凤仙花花青素苷抗氧化活性试验

进行抗氧化活性实验时，花青素苷与维生素C在比较时均在相同质量浓度下进行。

如图5所示，凤仙花花青素苷和维生素C在实验质量浓度范围内对DPPH自由基均有较好的清除能力。质量浓度较小时，维生素C对DPPH自由基的清除率高于花青素苷，随质量浓度的增大，花青素苷对DPPH自由基的清除率高于维生素C，花青素苷的清除能力逐渐增大。

图5 DPPH自由基清除率测定

如图6所示，凤仙花花青素苷和维生素C在实验质量浓度范围内对ABTS自由基均有一定的清除能力。随质量浓度的增大，纯花青素苷对ABTS自由基阳离子的清除率高于维生素C对ABTS自由基阳离子的清除率。花青素苷的质量浓度越大，清除ABTS自由基阳离子的能力越好。

图6 ABTS自由基清除率测定

如图7所示。质量浓度较小时，维生素C与花青素苷的吸光度相近，随质量浓度的增加，花青素苷的吸光度高于维生素C，由此可见花青素苷的还原能力高于维生素C。

图7 还原力测定(铁氰化钾法)

3 结论与展望

由实验结果可知，优化后的凤仙花花青素苷超声辅助提取因素条件为超声频率100Hz、乙醇浓度74%、提取温度43℃；提取率为：5.4039±0.3308 mg·g-1；且高浓度的凤仙花花青素苷对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力及其还原力均高于维生素C。故结果表明超声辅助法对凤仙花花青素苷的提取率较高，且凤仙花花青素苷具有较高的抗氧化活性。

由于花青素苷苷易受影响分解，吴敏综述表明天然花青素苷在酸性条件下比较稳定，在光线(特别是紫外线)下易分解或氧化，避光保存可降低花青素苷降解率，低温保存可延长其半衰期，且金属活性的副族金属离子可与花青素苷反应，影响其稳定性[29]。故花青素苷在保存时应确保其处于避光低温条件下。

花青素苷的提取方法较多，而超声波的空化作用能够促进样品分解，加大样品与溶剂的接触面积，进而提高提取率，故超声辅助提取法是一种简单快速，有应用前景的一种方法[30]；同样，花青素苷的提取剂多样，而以乙醇溶液为提取剂时，具有成本低，对环境污染较小等优点，故以超声辅助乙醇提取凤仙花花青素苷。在实验中往往会出现一些特殊情况，如以超声频率为单因素时，在超声频率为95Hz处，花青素苷的提取率会突然下降，通过文献查阅，发现姜桂全等研究表明：第一是因为超声波处理过程中空化泡沫剧烈压缩和崩溃的瞬间，产生的热氧化效应造成花青素苷的损失，而当热氧化效应造成的花青素苷的损失低于花青素苷提取增加速度时，花青素苷得率有所增加，第二，随着超声波的增加，与蛋白质等结合的花青素苷被提取出来，所以当超声波热氧化效应大于花青素苷提取率时，会显示为花青素苷的提取了降低，而在缔合的花青素苷提取率高于超声波热氧化效应时，花青素苷的提取率又会升高[25]。

有关于凤仙花花青素苷的提取相关文献较少，可能是凤仙花种类繁多，材料获取不易，并且全部进行实验时实验量过大等。但将笔者实验结果与其他材料结果相比，笔者试验结果均高于其他材料结果：如钮福祥等[31]对紫甘薯花青素苷的提取最优提率为723.1mg·kg-1；杨敏等[32]对紫玉米花青素苷的提取最优提率为3.542 mg·g-1；于莉莉等[27]对黑豆种皮花青素苷提取最优提率为3.87 mg·g-1；徐娟等[33]对蓝莓酒渣中花青素苷的提取最优提率为4.67 mg·g-1，而笔者实验的最优提率为5.4039 mg·g-1，略高于其他材料。

目前对物质进行体外抗氧化研究时，评价指标主要有：清除DPPH自由基、结晶紫法、亚硝基R盐-Co2+褪色法、2-脱氧-D核糖法、邻苯三酚(焦性没食子酸)的自氧化法、TAB硫代巴比妥酸法、清除ABTS自由基、抑制肝脏线粒体脂质过氧化检测法、还原力测定、抑制双氧水诱导的红细胞溶血能力实验、抑制蛋白质羰基生成法等。笔者对花青素苷进行抗氧化测定时，采取DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率以及对其还原力的测定，并分别与相同条件下维生素C对上述自由基清除能力以及还原力进行对比，结果表明凤仙花花青素苷具有较好的抗氧化能力。

花青素苷的抗氧化机理与黄酮类化合物通过酚羟基与自由基分子反应生成较稳定的半醌式自由基，终止自由基链式反应，以减少并清除自由基[34]相似。花青素苷的特殊抗氧化机制是通过对自由基的清除、金属离子的络合以及对抗氧化酶系的促进与激活[3]，进而达到抗氧化效果。

花青素苷作为一种天然色素，受到了人们的广泛关注，且在化妆品、医药、保健品等行业均具有广阔的应用前景。笔者实验结果为今后凤仙花花青素苷的研究提供了一定的基础，且超声提取时超声频率对提取率影响最大以及超声频率为95Hz时提取率下降的原因给花青素苷的研究提供了一个新的探究方向。在今后的研究中，可以继续寻求其最佳提取方法，优化提纯工艺；另一方面可以探究其大批量生产的最佳模式，为今后花青素苷的大规模应用提供依据。