基于ISSR和SRAP分子标记的22株鸡腿菇遗传多样性和亲缘关系分析*

高 傲，刘 宇，宋庆港，谷彤彤，廖燕玲，荣成博**

（1.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所北京市食用菌工程技术研究中心，北京100097；2.百色学院农业与食品工程学院，广西百色533000）

鸡腿菇（Coprinus comatus） 学名毛头鬼伞，属于层菌纲 （Hymenomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 鬼伞科 （Psathyrellaceae） 鬼伞属 （Coprinus）[1]。鸡腿菇子实体洁白、肉质细嫩可口、营养丰富，同时鸡腿菇还具有较好的保健和药用价值[2]。研究表明，鸡腿菇具有抗氧化、降血糖、降血脂、防止肝损伤、抗肿瘤、提高免疫力、抑菌等功效，是一种药食同源并极具开发前景的食用菌[3－6]。段懿涵等[4]研究发现，鸡腿菇多糖对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠具有较好的抗氧化活性，可起到降血糖作用。秦楠等[6]研究表明鸡腿菇菌丝发酵液具有抗枯草芽孢杆菌的能力，同时还具有抗氧化活性。崔旻等[7]研究发现，鸡腿菇多糖可以增加T淋巴细胞数量，并对人肝癌细胞SMMC－7721的体外增殖有一定抑制作用。另外鸡腿菇由于其外形独特，在观光采摘园区也备受青睐，因此鸡腿菇是近年开发的较具商业潜力的珍稀菌品，被誉为“菌中新秀”。

鉴于鸡腿菇在食用菌产业中具有重要潜力，该品种的育种也逐渐受到重视。食用菌种质资源是优良品种育种的基础材料，育种成效除了取决于种质资源的数量，还很大程度取决于对种质资源多样性的遗传特性掌握。分子标记作为食用菌遗传多样性研究中的重要手段，其应用越来越广泛[8]。

简单重复序列间扩增（inter－simple sequence repeats，ISSR） 是Zietkiewicz等[9]于1994年创建的一种新型分子标记技术，根据基因组中广泛存在的微卫星序列，设计通用引物对基因组DNA进行 PCR扩增，从而检测基因组中微卫星序列的变异，该技术具有重复性高和稳定性好的优点，在食用菌中得到广泛应用。相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP） 技术通过对外显子区域和内含子、启动子区域进行特异性扩增，从而使个体间产生多态性，近年来广泛应用在种群遗传多样性的分析中[10]。

由于不同的分子标记技术通过聚类分析产生的结果有所差异，因此本研究采用ISSR和SRAP两种分子标记技术进行综合运用以优化聚类分析结果，将收集到的22个鸡腿菇样本进行遗传多样性和亲缘关系研究，为鸡腿菇的鉴定、遗传育种及分类提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

本试验所用鸡腿菇菌株的名称及相关信息见表1。

表1 鸡腿菇样本及其来源Tab.1 Coprinus comatus samples and sources

1.1.2 试验试剂

葡萄糖、MgSO4购自国药集团化学试剂有限公司；KH2PO4购自西陇科学股份有限公司；琼脂粉、大豆蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司；VB1购自天津市光复精细化工研究所；三氯甲烷购自北京化工厂；2X Taq PCR Master mix购自北京永泽浩嘉生物技术发展中心；琼脂粉购自Life Technologies公司；试验引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。

1.1.3 仪器

Bio－Rad S1000 PCR 仪、Bio－Rad ChemiDocTMMP紫外凝胶成像系统、北京六一DYY－III－12B电泳仪、奥豪斯FR224CN电子分析天平、Eppendorf 5430R台式高速冷冻离心机等。

1.1.4 培养基

PDA综合培养基（1 L）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、琼脂粉 20 g、大豆蛋白胨 5 g、VB110 mg，ddH2O 1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 PCR 扩增

在PDA综合培养基平板上活化22个鸡腿菇菌种7 d～10 d，使用天根生化科技（北京） 有限公司植物DNA提取试剂盒（DP305） 进行DNA的提取。ISSR扩增体系以及扩增方法参照武海月等[8]的方法，ISSR－PCR 反应总体积 20 μL，体系为：10 μL2×Taq PCR Master mix，10 μL 的 ddH2O，引物为 1 μL，模板为1 μL。将反应液加入PCR管进行扩增，引物序列见表2。

表2 ISSR引物序列Tab.2 ISSR Primer sequence

ISSR-PCR程序设定：94℃预变性4 min，后94℃变性30 s，以低于引物退火温度5℃复性45 s，72℃延伸 2 min，共 35个循环；72℃延伸 7 min，4℃保存。

SRAP-PCR扩增体系及扩增方法参照武海月等[8]方法，其中Me为正向引物，Em为反向引物，SRAP-PCR反应总体积20 μL，体系为：10 μL的2×Taq PCR Master mix，10 μL的 ddH2O，引物 F为 1 μL，引物R为1 μL，模板为1 μL。将反应液加入PCR管进行扩增，引物序列见表3。

表3 SRAP引物序列Tab.3 SRAP Primer sequence

SRAP-PCR程序设定：94℃预变性7 min，后94℃变性 1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，5个循环；后 94℃变性 1 min，50℃退火 1 min，72℃延伸 90 s，共38个循环；最后 72℃延伸 10 min，4℃保存。

使用1×Tris-乙酸（TAE） 配置的2%琼脂糖凝胶，130 V琼脂糖凝胶电泳约40 min，用紫外凝胶成像系统进行拍照。

1.2.2 数据统计及分析

将上述电泳图中同一水平上的可见条带标记为“1”，未扩增出条带标记为“0”，用NTSYSpc 2.10软件分析。

2 结果分析

2.1 ISSR引物扩增结果

以浓度一致的22株供试鸡腿菇菌株的基因组DNA为模板，通过对不同引物的筛选最终选出24条ISSR引物在供试菌株上扩增效果良好，每个菌株均可扩增出多条DNA条带，条带清晰、稳定、重复性好。ISSR引物842对22个鸡腿菇菌株的扩增结果见图1。

由图1所示，以引物842的扩增结果为例，不同的引物扩增条带数不同，扩增出的DNA片段的分子量大多为200 bp～2 000 bp，包含了丰富的多态性信息。

图1 引物842的22株鸡腿菇菌株扩增结果Fig.1 The amplification results of 22 Coprinus comatus strains with primer 842

2.2 SRAP引物扩增结果

以浓度一致的22株供试鸡腿菇菌株的基因组DNA为模板，通过对不同引物的筛选最终选出24对SRAP引物在目标菌株上扩增效果良好，每个菌株均可扩增出多条DNA条带。引物Me1/Em4对22株鸡腿菇菌株的扩增结果见图2。

由图2所示，筛选出的引物扩增出条带为3条～13条，扩增出的DNA片段的分子量大多为200 bp～2 000 bp。

图2 引物Me1/Em4的22株鸡腿菇菌株扩增结果Fig.2 The amplification results of 22 Coprinus comatus strains by primer Me1/Em4

2.3 多态性分析

统计32个电泳图的条带，记录为0或者1。根据统计结果计算出每种引物扩增出的条带总数、每种DNA扩出的条带数量、每种引物对应的多态性条带数量、多态性条带数量比例。24条ISSR引物和24对SRAP引物的多态性分析结果见表4、表5。

表4 24条ISSR引物的多态性表Tab.4 Polymorphism table of 24 ISSR primers

由表4、表5可知，24条ISSR引物共扩增出条带219条，其中多态性条带204条，多态性占比93.1%。24对SRAP引物共扩增出条带149条，其中多态性条带127条，多态性占比85.2%。24条ISSR引物和24对SRAP引物共扩增出368条DNA片段，其中多态性条带有331条，多态性比例为50%～100%，说明22株鸡腿菇遗传多样性比较丰富；不同引物扩增出每种DNA的条带数量为2条～13条，扩增出的DNA片段的分子量大多为200 bp～2 000 bp，包含了丰富的多态性。

表5 24对SRAP引物的多态性表Tab.5 Polymorphism table of 24 pairs of SRAP primers

2.4 聚类分析结果

根据ISSR和SRAP的结果综合进行聚类分析，结果见图3。

图3 22株鸡腿菇菌株聚类分析图Fig.3 Cluster analysis diagram on 22 Coprinus comatus strains

根据图3聚类分析结果可知，在相似系数为0.8水平上，可将22株供试鸡腿菇菌株分为4大类，表明22株供试鸡腿菇菌株间具有较大的遗传差异，第1 类 包 括 JZB2108001、 JB2108007、 JB2108009、JB2108003、 JB2108006、 JB2108010、 JB2108011、JB2108013、 JB2108014、 JB2108019、 JB2108005；第 2类包括 JB2108015、JB2108016、JB2108020、JB2108022、 JB2108025、 JB2108030、 JB2108028、JB2108029；第 3类包括 JB2108017；第 4类为JB2108012、JB2108023。而在0.97的相似系数水平上，除JB2108015和JB2108016两个菌株未区分开外，其余20株菌株均可单独分开。

2.5 主坐标分析

将条带统计结果用NTSYSpc 2.10软件进行主坐标分析，结果见图4。

由图4可知，通过对22株鸡腿菇的相似系数矩阵进行中心化处理，主成分分析表明二维图前2个主坐标分别解释总遗传变异的27.28%、15.15%，占总遗传变异的42.43%。主坐标分析与聚类分析相一致，将22株鸡腿菇分为了四类。

图4 22株鸡腿菇聚类散点图Fig.4 Clustering scatter diagram on 22 Coprinus comatus strains

2.6 不同鸡腿菇的遗传相似系数和遗传距离分析

22株鸡腿菇样本个体间的遗传距离为0.030 0～0.850 3，平均值为 0.316 9。其中，JZB2108017 与JZB2108023之间遗传遗传距离最大为0.850 3，其次是JZB2108020与JZB2108023遗传距离为0.826 9，而JZB2108015与JZB2108016遗传距离最小为0.030 0，其次为 JZB2108007与 JZB2108009的遗传距离为0.149 7。22鸡腿菇样本中个体间的遗传相似系数为 0.149 7～0.970 0，平均值为 0.683 0。其中，JZB2018015与JZB2108016之间遗传相似系 数最大为 0.970 0， 其次是 JZB2108007与JZB2108009遗传相似系数为0.945 9，而JZB2108017与 JZB2108023遗传相似系数最小为 0.149 7，其次为JZB2108023与JZB2108011遗传相似系数为 0.155 6。

综上所述，JZB2108015与JZB2108016亲缘关系最近，JZB2108017与JZB2108023亲缘关系最远。

3 讨论与结论

目前食用菌行业里菌种混乱，同种异名和同名异种现象严重，这极大地限制了食用菌行业的发展。传统的鉴别主要是在子实体层面对子实体的颜色、大小、外形等形态特征及其生理生化特征、生长速度等进行鉴别，该方法耗费时间长，准确率较低，易受外界环境因素影响，只能鉴定属内种水平[8]。

随着分子生物学技术的飞速发展，已有多种分子标记方法被应用到食用菌的分类鉴定当中。朱静娴等[11]利用38对引物对23株大球盖菇基因组DNA进行SRAP扩增分析，当遗传相似系数为0.84时，23株大球盖菇供试菌株被分为3个类群，多个地理位置相距较近的菌株在同一进化支上，表明遗传相似性与其地理位置有一定的相关性。李红等[12]利用9条引物对16个滑菇菌株基因组DNA进行ISSR扩增，在遗传相似系数为0.69时，16个滑菇菌株被分成五大类。目前分子标记技术在其他食用菌方面已经广泛运用，但在鸡腿菇中报道较少。王守现等[13]利用SRAP技术对6个鸡腿菇菌株进行了遗传性分析，在遗传相似系数为0.877 0的水平，可将6个菌株分成三类。由于不同的分子标记方法会有一定差异，因此将2种或多种分子标记方法结合使用会有效的减少差异，使结果更加准确而有说服力。

试验利用ISSR和SRAP两种分子标记技术，对22株不同来源鸡腿菇样本开展试验。使用筛选出的24条ISSR引物和24对SRAP引物，以这22株鸡腿菇样本的基因组DNA为模板，共扩增出条带368条，其中含有多态性条带331条，多态性条带占总条带比为89.9%，说明22株鸡腿菇样本具有较为丰富的遗传多样性，可优化的菌株种类多，有利于进行杂交选育获得优势品种。

经聚类分析发现在相似度为0.80水平上，可将22株供试鸡腿菇菌株分为四大类，表明22株供试鸡腿菇菌株间具有较大的遗传差异。其中JZB2108023与JZB2108025虽然均采集于北京海淀区凤凰岭，但是2种菌株并不属于一类；JZB2108017号与JZB2108023遗传相似系数为0.149 7亲缘关系最远，二者分别来自北京大兴区和海淀区凤凰岭，由此可以说明北京地区尤其是凤凰岭具有较丰富的生物多样性。JZB2018025与JZB2018030两个菌株分别来自北京凤凰岭、新疆和田，2株菌株生长的地理位置及气候条件相差甚大，但是经聚类分析，两者在同一分支，亲缘关系接近，说明鸡腿菇有异地引种，相互交流菌株的情况出现。综上，本研究明确了22株鸡腿菇的遗传多样性和亲缘关系，为鸡腿菇的种质资源鉴定和分子育种提供了理论依据。