SPME-GC-MS 结合ROAV 分析腐乳中的主体风味物质

樊 艳

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏南京 210023）

腐乳是我国的传统豆制品之一，由微生物发酵制得，一直以来以其独特的风味和醇厚的口感广受消费者的喜爱。其酿造史至今已有1000 多年[1]，产地分布广泛，种类繁多，按其色泽分有红腐乳、白腐乳、青腐乳等。虽然各地酿制的豆腐乳品种多样，但其酿造工艺流程基本无差别，主要由制霉胚、腌制、加调料、装坛、密封、发酵等6 个步骤组成[1]，不过因其所用配料不同，故产品之间风味各异。

近年来，学者对腐乳的研究主要集中在菌种[2]、营养成分[3]和风味物质这几个方面。腐乳发酵过程是一个复杂的生化过程[4-5]，Wei 等[6]的研究结果表明油腐乳的风味物质形成的主要途径有分解代谢和外源迁移，在腐乳发酵期间蛋白质、脂肪等大分子物质在酶解作用下经微生物分解代谢转化为风味物质，腐乳生产过程加入的辣椒、花椒和盐等辅料中的化合物会在后发酵阶段迁移至腐乳胚中，进一步参与发酵产生某些风味物质，大部分的挥发性物质具有独特的香气，这些物质共同赋予了腐乳独特的风味和滋味。胡文康等[7]比较分析了3 种不同类型腐乳中挥发性成分，结果表明用顶空固相微萃取提取挥发性成分可鉴定出102 种物质，红方腐乳含量较高的风味物质有11 种，白方和青方腐乳的特征风味物质之一分别是茴香脑和吲哚；王伦兴等[8]利用SPME-GCMS 联用技术分析了茶香腐乳和红腐乳中的挥发性风味物质，共检测出104 种化合物，茶香腐乳所检出的风味成分数量比红腐乳多6 种；蒋丽婷等[9]采HSSPME/GC-MS 分别对白腐乳的汤汁和腐乳块进行测定，得到的结论是腐乳块中挥发性成分的检出量和检出率均大于汤汁；Xiao 等[10]采用GC-O/AEDA 和ROAV 评价各风味物质对腐乳总体风味的贡献程度，结果表明丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、反-2,4-癸二烯醛和2,6-二甲基吡嗪为腐乳的特征风味物质。

风味是评价加工产品品质的重要指标之一[11]。在各种食品中鉴定出的所有挥发性化合物中仅有一小部分是食品总体风味的重要贡献者，大部分没有显著影响，而这些对食品风味有关键作用的化合物被定义为该食品的主体风味物质或关键风味物质[12]。ROAV 法是确定食品主体风味物质的一种新方法[12]，目前用ROAV 法确定腐乳关键风味物质的研究还很少。鉴于传统大豆发酵食品之一的腐乳，其家庭作坊式发酵工艺仍然有一定市场，本文选用2 种自制腐乳和2 种市购腐乳为原料，采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）检测挥发性物质，计算ROAV 值找到关键风味物质，分析比较两者的异同点，探讨家庭作坊制作的腐乳其风味组成和主要风味物质，旨在为研究腐乳的特征挥发性风味物质的机理和控制及优化腐乳的生产加工提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

用于自制腐乳的豆腐 本地某菜场，两种腐乳的编号分别为M1、M2；毛霉菌菌粉 济宁玉园生物科技有限公司；腐乳 本地某超市，为两种不同品牌的红方腐乳，编号分别为C1 和C2。

Avanti J-26 台式离心机 美国Beckman Coulter公司；含SPME 装置的多功能样品处理平台 德国Gerstel 公司；SPME 萃取头（50/30um DVB/CAR/PDMS）美国Supelco 公司；7890A-5975C 气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腐乳样品的制作 参考杭梅等[13]的制作方法，稍作修改，将豆腐切成4 cm×4 cm×1.5 cm 大小，上锅蒸5 min 后放置凉透。称取15 g 毛霉菌菌粉，加入500 mL 水，搅拌均匀，切好的豆腐块间隔（约1 cm）摆放在蒸锅上，将配好的菌悬液均匀喷洒至豆腐块的各表面，锅底加水，盖好盖子，在室温20 ℃条件下，1 d开始长毛，发酵3 d 后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。称取1 000 g 毛豆腐，风干去除水滴，蘸上40 g 的52度白酒，裹上50 g 盐、15 g 辣椒粉和1.6 g 花椒粉[1]，入瓶，M1 样品添加10 mL 食用油封面，M2 未用油封面，于阴凉处避光密封储存一周即可食用。

1.2.2 风味物质的分离 SPME 设置：精确称取3 g样品加入20 mL 顶空瓶中，多功能样品处理平台保温箱温度是60 ℃，平衡时间10 min，萃取时间30 min，250 ℃下解析时间300 s，并设定每次进样前老化萃取头的程序，老化温度260 ℃，老化时间30 min（初次老化时间120 min）[14]。

GC-MS 条件：参考崔晓红等[15]的方法，选用DB-5 MS 毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气He（纯度≥99.999%）；载气流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流进样；程序升温：起始温度35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min 升到80 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min 升到200 ℃，保持20 min。传输线温度是280 ℃，离子源是EI，离子源温度是230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量是70 eV，数据采集模式为全扫描（Scan），质量扫描范围m/z 30～450 amu。

1.2.3 风味物质的鉴定 挥发性物质的定性和定量：气质联用得到质谱数据经与NIST08.L 标准谱库检索鉴定，将匹配度大于90 的作为定性依据之一，将计算得到保留指数（retention index，RI）值与其他文献测定的RI 值进行对比确认，进一步对腐乳的挥发性成分进行定性[16]；采用峰面积归一化法进行定量，计算得到各风味物质的相对含量。

RI 值的测定：取正构烷烃混合标准品（C7～C40），浓度为500 mg/L，稀释100 倍，进样量1 μL，分流比10:1，溶剂延迟时间5 min，其余参数同上。计算公式[17]为

式中，tx是待测组分的保留时间，min；tn是碳原子数为n 的正烷烃（tn＜tx）的保留时间，min；tn+1是碳原子为n+1 的正烷烃（tx＜tn+1）的保留时间，min。

主体风味物质的评价方法：主体风味物质采用ROAV 法评价各挥发性成分对样品总体风味的贡献，计算公式为

式中，C%x、Tx是各挥发性成分的相对百分含量和相对应的感觉阈值；C%stan、Tstan是对样品总体风味贡献最大的组分的相对百分含量和相对应的感觉阈值。

ROAV 值越大的成分对样品总体风味的贡献越大，1≤ROAV≤100 的成分为样品的主体风味化合物，0.1≤ROAV＜1 的成分被认为是对样品总体风味具有重要修饰作用的化合物[18]。

1.3 数据处理

本文采用Excel 2007、Origin pro 2018C 对数据进行处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 挥发性物质的分析

通过对4 种腐乳样品挥发性物质采用SPMEGC-MS 联用仪进行检测，共测出74 种挥发性化合物，腐乳样品的总离子流色谱图（total ion current of chromatograms,TIC）如图1 所示，本实验所设置的参数能较好分离这些挥发性物质。

图1 腐乳挥发性成分的总离子流图Fig.1 Total ion current of chromatograms of flavor substances in Sufu

通过GC-MS 检测分析，对4 种腐乳样品的挥发性物质进行分类统计（表1），结果表明4 种腐乳挥发性物质的种类和相对含量都有明显差异，自制腐乳M1 和M2 中风味物质种类较市购腐乳C1 和C2 丰富。M1 共鉴定出36 种挥发性物质，相对含量最高的为烯烃类物质，其中萜烯类物质3-蒈烯占了43.81%；M2 共鉴定出31 种挥发性物质，相对含量最高的为醚类物质，其中茴香脑占了44.91%，是其他腐乳相对含量的2～374 倍；烃类物质是在M1 和M2 中被检出挥发性物质中种类和含量都较高的成分。C1 和C2 共鉴定出挥发性物质分别为27 种和14 种，二者中检出的乙醇是相对含量最高的醇类物质，分别为58.70%和59.45%。C1 和C2 中的酯类物质相对含量较M1 和M2 检出率高，分别为13.03%和39.93%。

表1 4 种腐乳挥发性物质GC-MS 鉴定结果Table 1 Identification of aroma compounds in four kinds of fermented soybean curd by GC-MS

续表 1

根据腐乳中检测出的挥发性物质绘制韦恩图（图2），可见4 种不同腐乳间的风味物质种类和含量区别均较大。共有的风味物质只有茴香脑1 种；M1、C1 和C2 共有风味物质有2 种，分别是癸酸乙酯和棕榈酸乙酯；C1 和C2 共有风味物质有5 种，分别是乙醇、月桂酸乙酯、亚油酸甲酯、9-十八酸乙酯和油酸乙酯；M1 和C1 共有风味物质有3 种，分别是苯乙醇、1,2,3,4,4a,5,6,8a-十八氢-7-甲基-4-亚甲基-1-（1-甲基乙基）-萘和2,6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）双环[3.1.1]庚-2-烯；M2 和C1 共有风味物质有2 种，分别是（-）-α-蒎烯和（S）-β-没药烯；M1、M2 和C1 共有风味物质有6 种，分别是（1S,8aR）-1-异丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氢萘、（1S-顺式）-1,2,3,4-四氢-1,6-二甲基-4-（1-甲基乙基）-萘、β-石竹烯、α-木乌龙烯、正十五烷和正十七烷；M1 和M2 共有风味物质有8 种，分别是4-异丙基甲苯、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1,4-环己二烯、3-蒈烯、（4aS-顺式）-2,4a，5,6,7,8,9,9a-八氢-3,5,5-三甲基-9-亚甲基-1-苯并环庚烯、顺式-（-）-2,4a,5,6,9a-六氢-3,5,5,9-四甲基（1H）苯并环庚烯、（R）-β-雪松烯、正十四烷和正十六烷。

2.2 主体风味物质的分析

风味物质的相对含量的高低并不能说明其对样品整体风味的贡献程度，还需结合风味物质的阈值进行评价，不同化合物的阈值不同，一些风味物质虽然相对含量很低，但由于其阈值低，对整体风味贡献也很大[20]，当其相对含量一定时，阈值越低的化合物越容易被嗅觉器官感知[21]。通过查阅书籍及相关文献中已报道的挥发性风味物质的香味阈值，共找到25 种挥发性物质的气味阈值（表2）。因此，本实验只对查到阈值的风味物质进行分析。茴香脑是M1 和M2 中相对含量最高且阈值较低的风味物质，对这两个样品的整体风味贡献最大，因此定义茴香脑为M1 和M2 的主体风味物质（Tstan=100）；乙醇是C1 和C2 中相对含量最高的物质，但阈值较高，所以定义相对含量较高且阈值较低的茴香脑和棕榈酸乙酯分别为C1 和C2 中风味贡献最大的物质（Tstan=100）。

按1.2.3 计算ROAV 值，结果见表2，乙醇、苯酚、茴香脑、β-石竹烯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、水杨酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬内酯、癸酸乙酯、棕榈酸乙酯和油酸乙酯是4 种腐乳的主体风味物质，大部分为酯类，这和Chung[28]的研究结果一致。对腐乳的整体风味有重要修饰作用的风味物质分别为苯乙醇、1-甲基-4-(1-甲基亚乙基)环己烯、对伞花烃、草蒿脑、二氢猕猴桃内酯、月桂酸乙酯、硬脂酸乙酯。

醇类物质大多具有令人愉快的气味[29]，C1 和C2中检测出的乙醇含量较高，酒香明显，这与蒋芳芳[30]的研究结果一致，是C2 的主体风味物质，而M1 和M2 中的醇类物质检出量低，这可能是由于本实验对这两种自制腐乳（汤汁较少）的采样多为腐乳固形物。M1 和C1 中检测出的苯乙醇是由蛋白质水解成的苯丙氨酸在酶解作用下代谢生成的，赋予了腐乳花甜香味，对M1 的整体风味有一定的修饰作用。

芳香族物质中的苯酚在白腐乳中也有报道[28]，可以防腐、杀菌，能够延长腐乳的保质期，可能来源于酪氨酸的分解[31]，也可能是腐乳发酵过程中由木质素配糖体降解生成的[32]，赋予了M1 甜香味，是其主体风味物质；对伞花烃对M1 的整体风味有重要修饰作用。2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚是C1 的主体风味物质，赋予了其坚果香味。

烃类物质（萜烯类化合物除外）的产生可能和脂肪的分解有关[33]，本实验检测到的烃类物质包含长链烷烃和烯烃，烷烃类物质由于其分子量大，且气味阈值较高[34]，香气特征一般不显著，所以对腐乳的总体风味贡献不大，Shahidi 等[35]认为饱和烃和不饱和烃在食品风味形成过程中发挥的作用均不大，故此处不展开分析，而烯烃类物质中的萜烯类化合物阈值较低，具有花香、果香味，对总体风味贡献较大，M1 和M2 中萜烯类物质种类丰富且相对含量较高，其中3-蒈烯多用于食用香精的配方[36]，可能与加入的香辛料有关，β-石竹烯是合成香料的原料，在M1、M2 和C1 中的ROAV 值均大于1，赋予了其辛香、木香味，是主体风味物质；(S)-β-没药烯具有木香、柑橘香、花香、果香、青香。

醚类物质主要来自于香辛料，具有强烈而愉快的香气[37]。茴香脑是4 种腐乳种共同检出的醚类物质，且相对含量较高且气味阈值低，具有茴香、辛香料、甘草气味。这与胡文康等[7]的研究结果一致；草蒿脑对M2 的整体风味有重要的修饰作用；间苯二甲醚赋予了M2 甜香、药香、果香和啤酒香香气。

酯类物质中多数小分子量的酯类化合物气味阈值低，具有独特气味，对腐乳的总体风味贡献较大，脂肪酸酯类物质的产生与腐乳发酵过程中醇和脂肪酸发生酯化反应有关[7,38-39]。分子量较大的酯类化合物阈值较高，但它们在腐乳中的浓度高于小分子量的酯类，所以对腐乳的风味贡献很大。本实验中检出的乙酯类物质种类较多，且含量也较高，其中3-苯丙酸乙酯和水杨酸甲酯在M1 中的ROAV 值较大，分别赋予了样品花香、果香和草药香味[22]；棕榈酸乙酯赋予了C1 奶油和酯香味；油酸乙酯赋予了C2 可可香味。

2.3 主体风味物质主成分分析

进一步比较这4 种腐乳主体挥发性风味物质的异同，本实验选取对腐乳挥发性风味贡献较大的物质进行主成分分析，结果见表3，根据特征值大于1 的原则[36]，共提取到2 个主成分，累计方差贡献率达98.59%。

表3 主成分的特征值及其贡献率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of the principal components

风味物质主成分载荷图如图3 所示，市购腐乳中的挥发性风味物质，如乙醇和棕榈酸乙酯，与主成分2 呈现较强的正相关，而自制腐乳中的挥发性风味物质，如茴香脑、γ-壬内酯、3-苯丙酸甲酯、水杨酸甲酯和β-石竹烯，与主成分2 呈现较强的负相关，表明这两类腐乳的主体风味物质的组成及相对含量有差异性，这可能与腐乳所使用的的原辅料及加工工艺有关。结合图3 可知，乙醇是C1 和C2 整体风味的主要贡献物质；茴香脑是M1 和M2 整体风味的主要贡献物质。

图3 主体风味物质的主成分载荷图Fig.3 Principal component analysis loading plot of the key flavor compounds

3 结论

本实验采用SPME-GC-MS 技术，从4 种腐乳中共检测出74 种挥发性风味物质，包含醇类、芳香族类、烯烃类、烷烃类、醚类、酯类和酮类化合物等；结合ROAV 探讨4 种腐乳的主体风味物质，分别是乙醇、苯酚、茴香脑、β-石竹烯、2-甲氧基-3-（2-丙烯基）苯酚、水杨酸甲酯、3-苯丙酸甲酯、3-苯丙酸乙酯、γ-壬内酯、癸酸乙酯、棕榈酸乙酯和油酸乙酯这；借助主成分分析知道茴香脑是M1 和M2 最主要的风味物质，乙醇是C1 和C2 最主要的风味物质。实验结果表明自制腐乳和市购腐乳在主体风味物质及其相对含量上存在差异性，这可能与所用原辅料和加工工艺不同有关。研究结果将为腐乳特征挥发性风味物质形成机理的研究以及生产加工提供理论支撑。本研究由于实验条件所限，未能采用气相色谱-嗅闻-质谱联用技术，今后可在样品的前处理和检测方法的多样性上展开研究。