昆布多糖对新生小鼠病毒性心肌炎的影响

王英娟，李迎侠，苏乐

1.榆林市第一医院，陕西 榆林719000；2.西安市中心医院，陕西 西安710000

柯萨奇病毒B3（coxsackievirus group B type3，CVB3）感染是诱发人病毒性心肌炎的最主要因素，直接造成心肌细胞损害，引起心肌细胞的变性和坏死［1－3］。病毒性心肌炎患者通过治疗均可自愈，但部分患者存在再次感染、病情反复的情况，严重者可能会引起心源性休克和心力衰竭，迅速恶化导致猝死［4］。昆布属翅藻科，性寒，具有利水消肿、消痰、软坚散结的作用［5］。昆布多糖（laminarin，LA）是从昆布中提取分离的多糖，具有抑菌、抗氧化、调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等作用，对新生小鼠心肌损伤具有一定的保护作用［6－7］，但对CVB3诱导心肌炎的作用尚不清楚。因此，本文主要探讨LA通过抑制NF－κB的活化对CVB3诱导的新生小鼠病毒性心肌炎病理损伤和免疫失衡的调节作用。

1 材料

1.1 动物BALB／c雄性新生小鼠100只，日龄3～5 d，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2017－0022，饲养于榆林市第一医院动物中心实验室，保持室温恒定为25℃，模拟昼夜光照，自由摄食与饮水，经本单位实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂LA（北京凯森莱科技有限公司，货号：9008－22－4）；CVB3（上海中山医院病毒性心脏病重点实验室）。肌红蛋白（myohemoglobin，Mb）、肌酸激酶同工酶－MB（creatine kinase－MB，CK－MB）和心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）试剂盒（上海研生生化试剂有限公司，批号分别为：190221、190316、190301）；诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和白细胞介素－10（interleukin－10，IL－10）ELISA试剂盒（美国R＆D公司，批号分别为：180816，180915）；TUNEL染色试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号：181213）；Bax、Bcl－2、NF－κB p65、p－p65、TNF－α、GAPDH（美国Santa Cruz公司，批号分别为：sc－7480、sc－7382、sc－372、sc－8008、sc－52746、sc－32233）；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG（美国Thermo公司，批号分别为：A16072、A16104）；HE染色试剂盒、IL－6免疫组化试剂盒、细胞裂解液、ECL化学发光试剂（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为：190308、190309、190224、190521）；琼脂糖（美国Invitrogen公司，批号：75510－019）；Real time PCR Master Mix（SYBR Green）（瑞士Roche公司，批号：04913850001）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RT－PCR试剂盒（百奥迈科生物技术有限公司，批号分别为：190224、190301、190206）。

1.3 仪器HX－II型小动物血压测量计（中国北京明心痛生物科技有限公司）；XD－202型倒置显微镜（中国南京江南永新光学有限公司）；DNM－9606型酶标分析仪（中国北京朗普新技术有限公司）；BioLab－410型生物信号采集和处理系统（德国Eppendorf公司）；Gel Doc XR型图像采集及图像分析系统（美国Bio－Rad公司）；Lightcycle 96 realtime－PCR检测仪（瑞士罗氏公司）；TaKaRa Thermal Cycler PCR仪（TaKaRa公司）；Nano－100微量检测仪（杭州奥盛公司），Ion S5TMXL测序系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）；超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；垂直凝胶电泳槽、DYY－6B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1 动物分组及模型复制采用随机数字表法将100只新生的BALB／c新生小鼠随机分为对照组（n＝20）、LA组（n＝20）、CVB3组（n＝30）和CVB3＋LA组（n＝30）。CVB3组和CVB3＋LA组腹腔注射0.1 mL CVB3病毒制备新生小鼠病毒性心肌炎模型［8］，对照组和LA组腹腔注射0.1 mL CVB3病毒培养液，CVB3组和CVB3＋LA组各随机选取3只小鼠，取心脏进行HE染色，若HE染色显示心肌细胞产生细胞病变，则为造模成功。造模后，LA组和CVB3＋LA组腹腔注射50 mg·kg－1的LA；对照组和CVB3组腹腔注射同体积的生理盐水，连续注射12 d。

2.2 检测新生小鼠心脏功能指标应用小动物血压测量计和生物信号采集分析系统测定各组新生小鼠尾部动脉收缩压（systolic blood pressure，SBP）、心率（heart rate，HR）和左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）。检测后收集新生小鼠血液并分离血清，然后将新生小鼠处死，取心脏用于免疫组化分析及组织蛋白提取。

2.3 ELISA法检测血清相关指标采用ELISA检测新生小鼠血清中IL－10和iNOS水平及心脏损伤标志物Mb、CK－MB、cTn I水平。

2.4 新生小鼠心脏的病理变化每组随机取3只新生小鼠，取心脏固定于40 ng·L－1多聚甲醛中，进行常规的脱水、透明、包埋和切片，制作两份切片，一份切片进行HE染色，于光镜下观察肺组织的病理变化；另一份切片采用TUNEL法染色，严格按照TUNEL试剂盒说明进行染色，每张切片随机取5个视野拍照，计数每个视野下细胞总数及阳性细胞数，计算细胞凋亡率。

2.5 免疫组化对上述心脏切片进行免疫组化分析，二甲苯溶液浸泡2次后，梯度乙醇洗脱，加2滴3%H2O2－甲醇溶液，孵育10 min，加入血清封闭20 min，用一抗、二抗依次室温孵育30 min，DAB显色、复染、脱水封片。显微镜随机选取新生小鼠心肌组织6个不重复视野进行观察。

2.6 Western Blot法检测心肌组织相关蛋白表达

每组随机取3只新生小鼠，取心肌组织，提取总蛋白后，采用BCA法测定蛋白浓度并进行定量，依次进行12%SDS－PAGE电泳分离、转膜、封闭、一抗（Bax、Bcl－2、NF－κB p65、p－p65、TNF－α、GAPDH，稀释比例均为1∶1 000）孵育过夜、二抗（1∶500）孵育2 h、曝光、显影。Image J软件分析蛋白条带，计算各蛋白相对表达。

2.7 RT－PCR法检测心肌组织相关基因表达

每组随机取3只新生小鼠，取心脏，Trizol法提取总RNA，经反转录合成cDNA，以GAPDH为内参，进行RT－PCR反应，CVB3上游引物5′－CGGTACCTTTGTGCGCCTGT－3′，下游引物5′－CAGGCCGCCAACGCAGCC－3′，IFN－γ上游引物5′－CTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG－3′，下游引物5′－GCTGGACCTGTGGGTTGTTGA－3′，引物由上海生工生物技术有限公司合成，PCR反应体系为20μL，反应条件：94℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，共40个循环，用2－ΔΔCt法计算相对表达量。

2.8 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行数据分析。服从正态分布的连续型资料，采用单因素方差分析进行多组间比较，当组间差异有统计学意义时，进一步采用SNK方法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 检测新生小鼠心脏功能指标与对照组相比，模型组新生小鼠的SBP、HR和LVSP显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，CVB3＋LA组SBP、HR和LVSP显著升高（P＜0.01）。见图1。

图1 新生小鼠心脏功能指标

3.2 检测心脏损伤标志物与对照组相比，模型组Mb、CK－MB和cTn l水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，CVB3＋LA组Mb、CK－MB和cTn l水平显著下降（P＜0.01）。见图2。

图2 新生小鼠心脏损伤标志物

3.3 新生小鼠心肌组织的病理学变化和心肌细胞的凋亡HE染色显示，对照组和LA组新生小鼠的心肌组织排列紧密有序，横纹清晰；CVB3组心肌组织细胞排列疏散，横纹不清，细胞水肿，大量炎性细胞浸润；CVB3＋LA组心肌组织细胞排列紧密有序，横纹清晰，少量细胞水肿及炎性细胞浸润。TUNEL染色结果显示，与对照组相比，CVB3组心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与CVB3组相比，CVB3＋LA组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。Western Blot结果显示，与对照组相比，CVB3组Bax的表达显著上调，Bcl－2蛋白表达显著下调，Bax／Bcl－2水平显著升高（P＜0.01）；与CVB3组相比，CVB3＋LA组Bax蛋白表显著下调（P＜0.01），Bcl－2蛋白表达显著上调（P＜0.01），Bax／Bcl－2水平显著降低（P＜0.01）。见图3。

图3 新生小鼠心肌组织病理学损伤及相关蛋白的表达（HE，×200；TUNEL，×400）

3.4 RT－PCR法检测新生小鼠心肌组织中相关基因的表达与对照组相比，CVB3组心肌组织中CVB3 mRNA和IFN－γmRNA表达显著升高（P＜0.01）；与CVB3组相比，CVB3＋LA组心肌组织CVB3 mRNA水平显著降低（P＜0.01），IFN－γ mRNA水平显著升高（P＜0.01）。见图4。

3.5 检测新生小鼠血清和心肌组织中的炎症因子

免疫组化结果显示，与对照组相比，CVB3组心肌组织中IL－6表达显著升高（P＜0.01）；与CVB3组相比，CVB3＋LA组心肌组织中IL－6表达显著降低（P＜0.01）。ELISA结果显示，与对照组相比，CVB3组iNOS水平显著升高（P＜0.01）；与CVB3组相比，CVB3＋LA组血清中iNOS水平显著降低（P＜0.01），IL－10水平显著升高（P＜0.01）。见图5。

图4 新生小鼠心肌组织CVB3 mRNA和IFN－γmRNA水平

图5 检测新生小鼠血清和心肌组织中的炎症因子

3.6 Western Blot法检测心肌组织中的相关蛋白表达与对照组相比，CVB3组p－p65和TNF－α的蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与CVB3组相比，CVB3＋LA组p－p65和TNF－α的蛋白表达显著下调（P＜0.01）。见图6。

图6 Western Blot法检测心脏中的相关蛋白表达

4 讨论

CVB3感染会直接造成心肌细胞损害，已成为儿童时期常见的心血管疾病［9－11］。目前临床对病毒性心肌炎主要选择免疫治疗和抗病毒治疗，但疗效并不理想［12－14］。昆布是海带科植物海带或翅藻科植物昆布（鹅掌菜）的干燥叶状体，味苦、性寒，归肝、胃、肾经，LA是从昆布中获得的大分子多糖。研究表明，LA具有降压、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、调节免疫、抗氧化等作用［15－16］。因此，本文通过CVB3诱导新生小鼠病毒性心肌炎模型，研究LA对病毒性心肌炎小鼠病理损伤和免疫失衡的调节作用。本研究发现，LA对健康新生小鼠的心肌组织无影响，CVB3诱导病毒性心肌炎模型新生小鼠的SBP、HR和LVSP指数显著降低，CVB3 mRNA和IFN－γmRNA水平明显升高；经LA治疗后，CVB3 mRNA显著降低，SBP、HR、LVSP和IFN－γmRNA显著增加，提示LA可能通过促进IFN－γ的表达，降低机体的CVB3 mRNA水平，改善修复病毒性心肌炎小鼠的心脏功能损伤，临床有望应用昆布提高机体免疫，发挥抗病毒作用。同时，CVB3诱导病毒性心肌炎新生小鼠可发生细胞凋亡，经LA治疗后，新生小鼠心肌组织病理变化明显减轻，且LA能上调Bcl－2蛋白表达，抑制促凋亡蛋白Bax的表达，显著降低Bax／Bcl－2水平，与Tian等［17］研究是一致的，LA可抑制细胞凋亡相关蛋白表达，调节细胞的凋亡，提示LA可能调节凋亡蛋白Bcl－2和Bax的表达，抑制心肌细胞凋亡，减轻心肌组织损伤。

炎症反应是心肌炎的主要病症之一，炎症因子在该疾病中起重要作用［18－20］。本研究发现，经LA治疗后，iNOS和IL－6表达显著降低，IL－10的表达显著增加。iNOS、IL－6和IL－10均为机体常见的可反映全身炎症反应状态的细胞因子，其水平升高可进一步加重心肌组织损伤［21－23］，提示LA可降低机体炎症因子水平，减轻心肌组织损伤。同时，LA能抑制病毒性心肌炎模型小鼠心肌组织中p65蛋白磷酸化，下调TNF－α蛋白表达，抑制炎症因子释放。NF－κB信号通路广泛存在于真核细胞内，参与多种基因的调控，对细胞的增殖、分化、凋亡和炎症反应有重要作用［24－27］。在NF－κB信号传递中，活化的p65蛋白起着主要的调节作用，可调节下游靶蛋白TNF－α的表达，调节从而抑制炎症反应［28－30］，提示LA可能通过抑制NF－κB信号通路，抑制炎症因子的释放。

综上所述，LA可能通过抑制NF－κB p65蛋白磷酸化，下调TNF－α蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡和炎症因子释放，修复CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠的心脏功能，临床有望应用昆布治疗病毒性心肌炎，保护心肌组织损伤。