北京市昌平区耐多药结核分枝杆菌对新抗结核药品的耐药情况分析

刘新宇 张倩 孙倩

耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)及广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)是我国结核病疫情控制的主要障碍，加剧了对我国公共卫生的威胁。因此，迫切需要改进现有的治疗方案和开发新的抗结核药品。基于有效性与安全性，世界卫生组织于2018年发布了新的MDR-TB治疗指南，将药物重新归为三类[1]。但关于这几种药物在北京市昌平区MDR-TB患者中的耐药特点仍然未知。本研究通过分析A组药品中的左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)、贝达喹啉(bedaquiline，Bdq)和利奈唑胺(linezolid，Lzd)，B组药品中的氯法齐明(clofazimine，Cfz)，以及C组药品中的德拉马尼(delamanid，Dlm)对MDR-TB临床分离株的体外抑菌活性，初步了解北京市昌平区耐多药结核分枝杆菌菌株对这几种药品的敏感性和耐药突变类型，为药品的临床应用提供实验室依据。

材料和方法

一、研究材料

2011—2015年北京市昌平区结核病防治所从收治的结核病患者痰标本中分离培养及菌种鉴定后共获得1099株结核分枝杆菌临床分离株，收集其中耐多药结核分枝杆菌(83株，占7.6%)作为研究资料。结核分枝杆菌标准株H37Rv(ATCC27294)由国家结核病参比实验室提供。

二、研究方法

1. 最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations，MIC)药物敏感性(简称“药敏”)检测：对耐多药结核分枝杆菌按照文献[2]的标准进行Lfx、Mfx、Lzd、Bdq、Cfz和Dlm的MIC检测。每种药品的临界浓度见表1[3-5]。

表1 药物最小抑菌浓度范围和临界浓度

2. DNA提取和耐药基因检测：将结核分枝杆菌临床分离株接种于L-J培养基，37 ℃培养4～8周，至有菌落生长后，取一接种环菌于400 μl TE缓冲液(pH 值为8.3)中悬菌，100 ℃煮沸15 min，在8 cm离心半径下以12 000 r/min离心10 min，取上清-20 ℃保存备用[6]。耐药基因用相应的引物进行扩增(表2)。25 μl反应体系：包括2×PCR TaqSuperMix预混液12.5 μl、引物(10 mol/L)各 0.5 μl，模板5 μl，去离子水6.5 μl。PCR 扩增条件：94 ℃ 变性 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共 35个循环，72 ℃再延伸 10 min。PCR阳性产物测序均委托北京擎科生物有限公司完成。采用Bioedite软件将耐药基因测序结果与标准株进行比对分析。

表2 扩增和测序引物序列

三、统计学处理

采用 Excel 2010录入数据，通过 Backlink程序转换为Whonet文件，导入 Whonet 5.6软件，采用数值比例法对耐药数据进行分析。

结 果

一、耐多药结核分枝杆菌菌株耐药特征

83株耐多药结核分枝杆菌对不同药品的耐药情况见表3。耐多药结核分枝杆菌对Lfx和Mfx的耐药率最高，均为41.0%；其中，39株对Lfx或Mfx耐药，29株对Lfx和Mfx交叉耐药。耐多药结核分枝杆菌对Bdq的耐药率最低，为2.4%。对Cfz的耐药率为3.6%；3株Cfz耐药菌株中有2株对Bdq耐药。

表3 83株耐多药结核分枝杆菌对不同药品的耐药情况

二、耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变情况

1. 氟喹诺酮类药品耐药基因突变：39株对Lfx或Mfx耐药的菌株中，gyrA基因的第94位密码子的碱基替换是最常见的突变类型，占87.2%(34/39)；其中13株(33.3%，13/39)突变类型为Asp94Gly，11株(28.2%，11/39)突变类型为Asp94Tyr，6株(15.4%，6/39)突变类型为Asp94Ala，4株(10.3%，4/39)突变类型为Asp94Asn；第90位密码子的Ala90Val为第二常见的突变类型。所有耐药菌株均在gyrA基因的第95位密码子存在Ser95Thr突变类型，但Ser95Thr突变与耐药无关。在gyrB基因中未发现非同义突变。见表4。

表4 耐药菌株的耐药基因突变类型

2. 其他药品耐药基因突变：3株Cfz耐药菌株在rv1979c基因中均未发现突变。在Bdq耐药菌株中也未发现atpE基因突变。2株Cfz-Bdq交叉耐药菌株均在Rv0678基因中存在突变，1株突变类型为Gln31Arg，另一株突变类型为Ser53Pro。在4株 Lzd耐药菌株中，有2株在rplC基因中存在突变，突变类型为Cys154Arg，而在23SrRNA基因和rplD基因中均未发现突变。在4株Dlm耐药菌株中，1株突变发生在fbiC基因的第318位密码子，2株突变发生在ddn基因的第81位密码子，而在fbiA、fbiB和fgd1基因中均未发现突变。

讨 论

目前，MDR-TB已成为阻止全球结核病控制的一大障碍。根据世界卫生组织发布的MDR-TB治疗方案，笔者分析了A、B和C组常用药品的耐药特点，并阐明了这些耐药菌株的遗传突变特征，为临床用药提供指导意义。

本研究结果显示，北京市昌平区耐多药结核分枝杆菌对Lfx和Mfx耐药率均为41.0%。来自中国东部地区的一项研究表明，耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药品的耐药率为37%[7]。中国南方地区的一项研究发现，结核分枝杆菌对Lfx和Mfx的耐药率分别为76%和73%[8]。另一份来自上海的报告显示，在耐氟喹诺酮类药品的结核分枝杆菌中，44%为耐多药结核分枝杆菌[9]。我国氟喹诺酮类药品的耐药率高，可能是由于患者在治疗未确诊的细菌感染时存在过度使用，表明在临床实践中需要采取迫切行动来控制氟喹诺酮类药品的滥用。Mokrousov等[10]的研究显示，87.2%的氟喹诺酮类药品耐药菌株在gyrA基因的耐药决定区存在突变，其中第94位密码子是最常见的突变位点，但未发现gyrB基因突变。第94位密码子的突变频率(87.2%)与俄罗斯报道的83%相似，但高于中国香港的75%[11]和卢旺达的75%[12]，表明gyrA基因的耐药决定区突变是导致北京市昌平区结核分枝杆菌耐氟喹诺酮类药品的关键因素。

本研究中，95%以上的耐多药结核分枝杆菌对Bdq和Cfz敏感。尽管目前这两种药品是MDR-TB治疗方案的组成部分，但研究发现Rv0678基因突变能够促进外排泵MmpS5-MmpL5过表达，导致这两种药品出现交叉耐药[13]，与文献[14]的研究结果一致。本研究的数据表明，3株Cfz耐药菌株中有2株存在Rv0678基因突变，且对Bdq存在交叉耐药。而在无Rv0678基因突变的Cfz耐药菌株中，未发现Rv1979c基因突变。因此，需要通过鉴定新的突变位点来增强对Cfz耐药机制的深入了解。虽然孙晴等[14]的研究表明，atpE基因突变与Bdq耐药有关，但在本研究中未发现atpE基因突变，其他的机制可能参与Bdq耐药。

Lzd可有效治疗MDR-TB，根据以往的研究表明，rplC基因的T460C突变是Lzd耐药菌株中最常见的突变类型[15]。本研究中，50%的MDR-TB临床分离株中存在rplC基因突变，这与之前报道的一致。此外，Schena等[5]研究表明，ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC任一基因的多态性均可导致Dlm体外耐药。其中，ddn基因编码一种依赖于F420的分枝杆菌硝基还原酶，与前药激活有关[14]。最近一项研究表明，10株耐多药结核分枝杆菌菌株中有5株在ddn基因中存在突变[16]。而在本研究中共鉴定了2株含有ddn基因突变的耐多药结核分枝杆菌。FbiC基因作为辅酶F420生物合成途径的重要成员[17]，也参与了Dlm的耐药。在本研究中，3株 Dlm耐药菌株中，有1株在FbiC基因中存在突变，表明FbiC基因突变是导致Dlm耐药的重要因素。

综上所述，北京市昌平区耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药品耐药率较高，而对Bdq、Lzd、Dlm和Cfz表现出较好的敏感性。研究结果可为MDR-TB患者选药时进行参考，为北京市昌平区应用新型抗结核药品治疗MDR-TB提供理论依据。