体外诱导扩增γδT细胞对甲状腺癌细胞杀伤作用的研究

贾辰乐,史克骏，南 杰，张 蕾

(山西省肿瘤医院，山西 太原 030013)

我国头颈部肿瘤的年发病率为15.22/10万,占全身恶性肿瘤的4.45%，而且近年来发病率呈现明显的升高趋势，严重威胁着人类健康。头颈部肿瘤类型多，以甲状腺癌发病率最高。虽然经过了几十年的不断努力，诊疗手段已有显著的提高，但甲状腺癌的生存率没有明显提高。在现有的手术、放化疗等传统治疗方式之外，寻找新的治疗方法是当前研究的热点。

过继免疫细胞治疗作为一种副作用小的新型疗法近些年来受到科学界广泛关注。比如细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK)，树突状细胞(DCs)，自然杀伤细胞(NK)，抗原嵌合受体T细胞(CAR-T)等[1]。这些细胞在体内外均证实有较强的抗肿瘤效应，但由于杀伤效率低，培养成本较高而受到一定的限制。γδT细胞是构成机体固有免疫的一种重要细胞，特别在早期抗癌阶段具有重要的作用，其抗原识别是非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的，不依赖抗原的处理和呈递过程，对肿瘤抗原的识别具有广谱性特点[2-4]。虽然有报告证实其具有一定的杀肿瘤效应，但它的体内外杀伤活性研究报告相对较少[5]。在本研究选用甲状腺癌肿瘤细胞作为靶细胞，研究γδT细胞的杀伤作用，为γδT细胞作为过继细胞免疫治疗应用于临床提供前期研究基础。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器

PE标记CD8、CD56、CD25、TCR-γδ的鼠抗人McAb及FITC标记的CD4、HLA-DR、TCR-αβ的鼠抗人McAb均购自BD PharMingen公司；MTT检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；人外周血淋巴细胞分离液购自GE公司；注射用重组人白介素-2(IL-2)购自北京双鹭药业股份有限公司；唑来膦酸(天晴依泰)购自正大天晴药业集团股份有限公司；RPMI1640培养液、胰酶为Gibco公司产品；流式细胞仪为美国BECKMAN公司(FC500)；SW579细胞由中科院生物物理所惠赠。

1.2 方法

1.2.1 γδT细胞培养及鉴定 采集健康志愿者外周血，淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人单个核细胞(PBMCs)，用RPMI1640培养液调整细胞密度为2×106/mL接种于25 mL培养瓶，培养当天加入唑来膦酸1 μmol/L和IL-2 300 U/mL，置于37℃、5%CO2条件下细胞培养箱内培养，每3 d更换一半培养液，待细胞密度长至80%左右时陆续转至75 mL、175 mL培养瓶，培养15 d收集γδT细胞，取样，PBS洗涤3次后，分别加入CD3、CD4、CD8、CD56、CD25、HLA-DR、TCR-αβ、TCR-γδ单克隆抗体，鉴定γδT细胞的纯度。

1.2.2 γδT细胞杀伤实验 调整对数生长期SW579、Hep-2细胞浓度为1×106/mL，作为γδT细胞体外杀伤的靶细胞，选取培养15 d的γδT细胞作为效应细胞，按照5∶1、10∶1、20∶1、40∶1的效靶比，每孔加入效应细胞与靶细胞各100 μL于96孔细胞培养板，同时设每个效靶比相应的效应细胞和靶细胞对照。37℃共育4 h后，各孔加20 μLMTT(5 mg/mL)，继续培养4 h，离心弃上清，加入DMSO 200 μL/孔，轻柔振荡10 min，酶标仪460 nm检测。杀伤率按下式计算：

杀伤率=[靶细胞对照孔A值-(实验孔A值-效应细胞对照孔A值)]/靶细胞对照孔A值×100%

1.3 统计学方法

SPSS10.0软件进行统计学分析，计数资料采用%表示，进行检验，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两类间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外成功培养鉴定γδT细胞

PBMCs经过15 d培养，得到了百倍以上的细胞扩增，经过流式细胞仪鉴定CD3-CD4-T:1.74%，CD3-CD8-T:5.02%，CD3-CD56-T:12.66%，CD3-HLA-DR-T:74.64%，CD4-CD25-T:0.38%，CD3-δβTCR-T:3.08%，CD3-γδTCR-T:87.28%，获得了高纯度的γδT细胞(见图1)。

图1 γδT细胞免疫表型鉴定

2.2 γδT细胞对头颈部肿瘤细胞SW579的杀伤作用

从表1中可以看出，在40∶1、20∶1、10∶1、5∶1的效靶比时，γδT细胞对甲状腺癌细胞及SW579均有明显的杀伤作用，杀伤效率随着效靶比升高而增大，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)；而γδT细胞针对两种细胞杀伤之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 不同效靶比γδT细胞对两种靶细胞的杀伤率表 %

3 讨论

γδT细胞是介于特异性免疫与非特异性免疫之间的一种特殊类型的免疫细胞，主要分布于皮肤和黏膜组织，一般不超过T细胞总数的5%，γδT细胞处于机体免疫防护系统的第一线，在抗肿瘤免疫中具有重要作用，具有细胞毒性和分泌多种细胞因子及趋化因子的功能。γδT细胞是一种能识别癌抗原的免疫细胞又能杀伤癌细胞，主要用于识别癌细胞抗原，将这些抗原传递给其他效应细胞，从而达到杀伤癌细胞的效果。但由于其数量有限，而且肿瘤患者本身的T细胞功能常常处于抑制状态，因此，如何有效地在体外扩增活化纯度较高的γδT细胞成为近些年研究的热点。

本次研究使用唑来磷酸与IL-2联合培养人体外周血PBMC，经过15 d培养获得纯度高的γδT细胞，与国内外报告类似[6]。然后选择头颈部常见的甲状腺癌细胞与细胞株SW579作为靶细胞验证γδT细胞在体外的抗瘤活性，结果显示在不同的效靶比作用下，γδT细胞均有良好的抗肿瘤效应，而且随着效靶比的增高，抗肿瘤活性也逐步升高，本研究中设定的浓度界值为40∶1，研究发现随着浓度的继续升高，对肿瘤细胞的杀伤作用不再增高，而对正常细胞却有明显杀伤，这与国内外对免疫细胞治疗达成的共识保持一致，国外的相关研究也曾有报道[3]。γδT细胞针对两种类型肿瘤细胞的杀伤活性没有明显差异，也证实了γδT细胞主要以非特异性机制对抗肿瘤，具有广谱的抗肿瘤效应。本研究虽然对头颈部高发病甲状腺癌进行了不同效靶比中γδT细胞对两种靶细胞的杀伤率的比较，但局限于样本数量，以及对甲状腺癌不同类型的治疗效果的比较，以及头颈部其他类型恶性肿瘤之间的比较，因此要想实现规模化应用于临床还需要多中心大样本对照，以及对γδT细胞对头颈部肿瘤细胞杀伤作用机制的更深研究。

综上所述，γδT细胞能分泌大量细胞因子,参与体内多种生理及病理过程,在免疫监视及免疫防御等方面具有重要作用,可对癌细胞产生有效的细胞毒性反应。目前临床试验结果表明,γδT细胞在抗肿瘤方面展现出了良好的应用前景 体外高效诱导扩增γδT细胞简单可行，扩增的γδT细胞对甲状腺癌有明显的杀伤效应，而且杀伤率随着效靶比的升高而增大，但达到40∶1为临界点。γδT细胞可以作为一种过继免疫细胞在临床上进一步进行研究。