乳酸降解菌在白酒酿造中的研究进展

王新叶，李芳香，张依香，钟艳霞，莫新良，赵 亮

（茅台学院 酿酒工程系，贵州 仁怀 564500）

乳酸（2-羟基丙酸）（C3H6O3）及其酯类是中国白酒中重要的成分，其在各香型酒中所占的比重差异较大[1]。在清香型白酒中，乙酸乙酯和乳酸乙酯的绝对含量及两者之间的比例关系，对清香型白酒的质量和风格特征有很大的影响，一般乙酸乙酯与乳酸乙酯的含量比例为1∶（0.6～0.8）左右[1]。在浓香型白酒中，四大酯（己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯）、四大酸（己酸、乳酸、乙酸和丁酸）占酒体中酯、酸类物质的98%以上，其中己酸乙酯与乳酸乙酯的比值多在1∶（0.5～0.8）之间[2]。但在白酒生产过程中，普遍存在乳酸乙酯含量过高的问题，导致乳酸乙酯与主体香的比例失调，严重影响白酒的品质[1，3]。

在白酒酿造过程中，乳酸乙酯的产生是多种微生物代谢作用的结果，它分别由乳酸菌代谢产生的乳酸和酵母菌代谢产生的乙醇来提供酯化的前体，然后在丁酸菌等微生物提供的酯化酶作用下酯化生成[4]。乳酸乙酯性质稳定，不易被分解，可以通过降低乳酸乙酯的前体物质——乳酸，降低白酒中的乳酸乙酯含量[5]。在白酒生产过程中，实现“降乳”主要有以下几种方式：①添加辅酶，添加食用级富马酸可以抑制乳酸菌生长。然而添加富马酸会增加白酒酿造成本，同时也会干扰微生物的其他代谢途径；②控制与优化生产工艺：使用优质陈曲，减少用曲量；缓火蒸馏，量质接酒；及时清理黄水，确保生产环境卫生。通过优化操作工艺，可以在一定程度上降低生产过程和基酒中乳酸乙酯的含量，但是“治标不治本”；③在发酵过程中添加乳酸降解菌，这些乳酸降解菌株来源于发酵过程，成本低，不影响其他微生物的生长代谢[6]。

已见报道的乳酸降解菌主要是从清香型白酒、浓香型白酒和特香型白酒的酿造过程筛选出来的8个属，种质资源有待进一步开发。酱香型白酒生产过程中，乳酸是酒醅中的主要酸类物质，在中后期轮次酒醅中乳酸含量可以达到20～40 g/kg酒醅，在酱香型白酒这样酸性酿造环境的胁迫和驯化下，一些酿造微生物已经对乳酸具有较强的耐受性和利用能力[7]。因此，酱香型白酒的酿造环境可以作为乳酸降解菌菌种的种质资源库，为筛选获得具有应用价值的乳酸降解菌提供原材料。

1 乳酸降解菌的种类

乳酸降解菌也称乳酸利用菌，是指能够利用乳酸作为碳源或者电子受体的一类微生物[6]。在酿酒环境中，乳酸降解菌在大曲、窖泥和酒醅中都有分布，大部分是兼性厌氧菌[5-6，8-9]。已见文献报道的乳酸降解菌有丙酸杆菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属、泥杆菌属、脱硫肠状菌属、葡萄球菌属、土孢杆菌属等[6，10]。丙酸杆菌属的菌株是报道最早的乳酸降解菌[10-11]。芽孢杆菌属的菌株最多，包括解淀粉芽孢杆菌、芹菜芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、富马芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、半乳糖芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及特基拉芽孢杆菌的15个菌株[5，9，12]。其次是梭菌属，包括七叶梭菌、肉毒梭状芽孢杆菌、丁酸梭状芽胞杆菌、天青梭状芽胞杆菌、耳蜗梭状芽孢杆菌、马氏梭状芽胞杆菌、玫瑰梭状芽孢杆菌、塞内加尔氏梭菌、梭状芽孢杆菌、产芽孢梭状芽孢杆菌、酪丁酸梭菌的11个菌株[13-15]。

不同种属的菌株对乳酸的降解率差异很大，芽孢杆菌属的菌株中，除个别菌株外，大部分菌株对乳酸的降解率都能达到100%[9]；梭菌属的菌株中，耳蜗梭状芽孢杆菌对乳酸的降解率能达到90%以上，其他种的菌株对乳酸的降解率均低于70%[6]。其他属的菌株中，泥杆菌属对乳酸的降解率为100%，脱硫肠状菌属、拉乌尔菌属、葡萄球菌属、土孢杆菌属的菌株对乳酸的降解率均在40%以下[6]。

乳酸降解菌的发酵产物主要有醇类、酸类和酯类。不同属的乳酸菌发酵产物不同，芽孢杆菌属的菌株发酵都会产生乙醇，而梭菌属、脱硫肠状菌属、泥杆菌属、土孢杆菌属的菌株发酵都不产生乙醇，但会产生丁醇、戊醇、己醇和辛醇等[6，9]。而不同来源的乳酸降解菌发酵产物也有一定差异，镇达等[9]从黄水、酒糟、大曲中分离得到的乳酸降解菌都属于芽孢杆菌属，但是来源于黄水的乳酸降解菌发酵产物只有乙醇，而来源于大曲的乳酸降解菌的发酵产物除乙醇外，还有丙酸、己酸、异丁醇和异戊醇等。

2 乳酸降解菌的筛选

2.1 培养基的优化

乳酸降解菌可以以乳酸或乳酸钠作为碳源，研究者们在筛选培养基中，添加乳酸或乳酸钠作为唯一碳源，将能在此类选择性培养基上生长的菌株初步认定为乳酸降解菌[6，16]。张国政等[16]最先以“乳酸钠1.0%，酵母膏0.5%，无机盐适量”为基础培养基从酒醅、窖泥和黄水中筛选出了190株乳酸降解菌，但其中只有10株菌的乳酸降解能力较强，降乳率在30%～60%之间。镇达等[9]以“每升含5 g乳酸，2 g酵母膏，2 g（NH4）2SO2，14.3 g Na2HPO4·12H2O，3 g KH2PO4，0.28 mg MnSO4·H2O，0.3 mg FeSO4·7H2O，0.06 mg MgSO4·7H2O，1 mg CaCl2，0.05 mg CuSO4，0.05 mg ZnSO4和0.05 mg H3BO3”的培养基从窖泥、出窖酒糟、黄水和大曲中分离筛选得到了16株乳酸降解菌，其中11株菌的乳酸降解率达到了100%，大部分菌株的乳酸降解率在60%以上。

2.2 具有耐受性的乳酸降解菌的筛选

酒醅是白酒发酵的主要载体基质，其微环境具有高浓度乙醇、高浓度有机酸、低pH等特点[6，17]。因此，菌株在高酸、高乙醇浓度下的降乳率也是重要的考察指标。

在白酒发酵过程中，伴随着营养物质的降解和微生物的繁殖生长，代谢生成大量有机酸使发酵酒醅维持酸性环境，泸型酒酒醅入窖时其pH值一般为4.0～5.0，发酵结束时维持在3.5～4.0左右[9，16]。随着pH的降低，菌株的乳酸利用率呈现下降趋势，而不同菌株对pH的耐受性差异很大。菌株Z4-5在pH 4条件下依然能够利用乳酸钠，降乳率可达到20%[16]。但是，大多数乳酸降解菌在pH 5以下无法生长[6，18]。这可能是由于对菌株pH耐受性的检测是在实验室液体发酵条件下进行的，而同样的酸度条件下液体环境会加强酸的抑制作用，某些可以在固态发酵条件下繁殖生长的微生物无法在液体培养条件下生存[18]。

高浓度的乙醇耐受能力是乳酸降解菌应用的前提，但目前研究获得乳酸降解菌的乙醇耐受能力并不理想。酒精度在4%vol以下，大部分乳酸降解菌都能快速生长；乙醇含量超过6%，菌株的乳酸降解率大幅度下降，而且大部分菌株生长受到明显抑制[6，16，18]。

乳酸是酒醅中含量最高的有机酸，在泸型酒中，发酵结束时其质量浓度范围在15～20 g/L酒醅左右，而在酱香型酒中，中后期轮次酒醅中乳酸含量达到20～40 g/kg酒醅[6-7]。王莉等[7]从酱香型白酒发酵酒醅中筛选到了一株库德里阿兹威氏毕赤酵母MY-Y01，对乳酸的耐受性可达到120 g/L，是酱香型白酒发酵过程中一株重要的酵母菌。

3 发酵液中乳酸含量的测定方法

乳酸是自然界最小的手性分子，主要由微生物发酵产生[21]。发酵液中乳酸的测定方法主要有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定法、对羟基联苯比色法、酶电极分析法及高效液相色谱法，发酵液中乳酸含量的测定方法见表1。

由表1可知，EDTA滴定法和对羟基联苯比色法简便快速，但重复性较差；酶电极分析法和高效液相色谱法测定更准确灵敏，但是成本相对测试成本较高[21]。此外，选择何种测定手段还受测定方法的成本以及对检测速度要求的影响[21]。

表1 发酵液中乳酸测定方法比较Table 1 Comparison of lactic acid determination method in fermentation broth

4 乳酸降解菌在白酒生产中的应用

国内对乳酸降解菌的应用研究始于20世纪80年代，由于丙酸菌在无氧状态下发酵可以将乳酸转变成二氧化碳、乙酸、丙酸和少量的琥珀酸，可以起到降低酒醅中乳酸含量的作用，因此丙酸菌是被最早应用在白酒生产上的菌种[10，26]。20世纪90年代以后，研究者们开始从白酒酿造环境中分离筛选具有乳酸降解功能的乳酸菌，直接将其应用于白酒生产过程，考察其对白酒中乳酸及乳酸乙酯的影响，但对菌株的种属及发酵特性并未做深入研究[20，27]。进入21世纪，部分乳酸降解菌的菌株作为菌剂添加到白酒酿造的曲粉和酒醅中，降低了基酒的乳酸及乳酸乙酯的含量，使酒体的香型风格更加典型[8，28]。此外，大部分菌株还处于实验室研究阶段，未投入生产使用[12，14，18，29]。

4.1 作为曲粉添加剂

大曲为酒之骨，白酒酿造用大曲的主要生产原料为小麦，大曲发酵过程中多种微生物经过驯化和富集，为酒醅发酵提供有益菌，集“物系”、“菌系”和“酶系”于一体，其丰富的微生物种类与酶类及多样的风味物质，对酿造酒的出酒率及酒体品质都有很重要的影响[30]。宋克伟等[8]将筛选到的乳酸降解菌B001添加到麸曲中，进行正常的清香型基酒生产；与对照组基酒相比，试验组感官同对照组一致，基酒中乳酸乙酯降低了25%，并且提高了14.6%的乙酸乙酯，起到了增乙降乳的作用，并且在品评上体现了清香型酒爽净、柔顺等特点。

4.2 作为酒醅添加剂

白酒生产是以窖池和酒醅为基础，依靠微生物、大曲微生物和窖泥微生物在窖池中进行着复杂的物质能量代谢的过程，酒醅在窖池环境中充当着物质循环、能量流动和信息传递的“三流运转”规律的载体[31]。刘复今等[20]将通过紫外诱变得到的乳酸降解菌添加到酒醅中，进行正常的清香型白酒发酵生产，与对照组相比，酒体中的乳酸乙酯含量降低，乙酸乙酯的含量升高，其感官品评结果均比原对照酒好，且试验酒的清香型风格均较对照酒典型。

4.3 作为窖泥养护剂

窖池都是浓香型白酒生产的主要设备和重要的前提条件。要产好酒，就必须有优质的窖池，而好的窖池其本质在于优质的窖泥，优质的窖泥能赋予浓香型白酒一种特殊的“窖香”[32]。但是，随着生产次数增加，窖泥会出现老化，老化的窖泥含水量低和透水能力差，并由表及里发展，窖泥内有白色粉末或细长针状结晶产生，白色粉末为乳酸钙，而针状结晶为乳酸亚铁[33-35]。造成这一结果的主要原因是酒醅酸度过大，造成乳酸积累，乳酸与黄泥中的Ca2+、Fe3+结合形成乳酸钙、乳酸铁沉淀，这些沉淀在窖泥中积累，造成窖泥板结。刘乐乐等[32]将能够降解乳酸合成己酸的酪丁酸梭菌、生孢梭菌和克氏梭菌按照一定比例混合制成功能微生物菌剂，用黄水稀释液和大曲粉混合制成糊状窖泥养护剂，酒窖起窖后，把糊状窖泥养护剂均匀地敷在窖壁和窖底表面能降低窖泥中乳酸积累，有效地避免窖泥板结。

5 展望

从白酒生产环境（大曲、窖泥、酒醅及黄水）中分离筛选得到的乳酸降解菌再添加到白酒生产过程，能够降低酒体中乳酸及乳酸乙酯含量，改善酒体的品质。由于乳酸降解菌来源于生产环境，这些菌株对白酒生产过程中其他微生物的代谢活动影响很小，具有很好的应用前景。但目前研究者只是从发酵材料中对乳酸降解菌进行分离筛选，对乳酸降解菌的种质资源多样性、群落结构、代谢调控方面未作系统深入研究。

利用乳酸降解菌制备低乳酸和乳酸乙酯含量的调味酒，可以对高乳酸和乳酸乙酯含量的缺陷酒进行调制，改善原酒的品质。与将乳酸降解菌作为菌剂直接添加到酿酒过程相比，制备调味酒的生产投入更少，成本更低，这必将成为乳酸降解菌应用领域研究的热点。