蒙药阿如日-4味丸的急性毒性和亚急性毒性评价

周枫叶，李 君，王嘉瑞，李启山，乔 晶，杨 倩

(1.内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，呼和浩特 010110；3.内蒙古自治区新药筛选工程研究中心，呼和浩特 010110；4.内蒙古医科大学临床医学院，呼和浩特 010110)

类风湿性关节炎(RA)是一种以关节病变为主的慢性、全身性、自身免疫性疾病，其病因复杂、症状多样、致残率高[1-2]，治疗的目的主要为改善症状、减少并发症及提高生活质量，临床治疗药物主要包括非甾体类抗炎药、抗风湿药及糖皮质激素类，但上述药物的长期高剂量使用会导致胃肠不适、肝肾功能损害及股骨头坏死、高血压等[3]。

蒙药阿如日-4味丸为蒙药经典验方，由制草乌、细辛、诃子和荜茇组成，具有消“黏”，除“协日乌素”，祛风、止痛和散寒等功效，由于处方中含有已证明有毒性的药材，如制草乌和细辛，为评价其安全性，课题组对其进行了急性毒性及亚急性毒性研究，以评价阿如日-4味丸的毒性、剂量与毒性反应的关系及可能对靶器官的影响，从而为临床安全用药提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 SysmexXT-1800i型全自动血液分析仪，希森美康医用电子(上海)有限公司；Sapphire600型全自动生化分析仪，北京欧迪创新生物技术有限公司；MC-4000plus型血凝分析仪，德国美创公司；DS-Y350型粉碎机，上海市顶帅工贸有限公司；BSA4202S型分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2试药 制草乌、诃子、荜菝和细辛药材，均购自东营百佳益中药饮片有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(批号20160810)，天津市光复精细化工研究所；生理盐水(批号D16070503)，山东华鲁制药有限公司；血液分析系统分析试剂，分别购自希森美康生物科技有限公司和上海太阳生物技术公司；血清生化分析试剂，宁波美康生物科技有限公司。

1.3动物 KM小鼠40只，雌雄各半，体质量为18～22 g；SD大鼠80只，雌雄各半，体质量为180～220 g，均购自内蒙古医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(蒙)2015～0001，饲养于内蒙古医科大学GLP中心屏障设施，实验动物使用许可证号为SYXK(蒙)2014～0003。温度控制在20～26 ℃，日温差≤3 ℃；相对湿度控制为40%～70%，每12 h明暗交替，每笼5只，饲喂Co60放射灭菌鼠全价颗粒饲料(北京科澳协力饲料有限公司)，自由饮水。

2 方法与结果

2.1急性毒性实验

2.1.1分组及给药 根据预试验结果，将小鼠按照性别及体质量随机分为对照组(5 g·L-1CMC-Na)和阿如日-4味丸组(12 g·kg-1)，每组20只，雌雄各半，给药体积按照体质量计(40 mL·kg-1)。

2.1.2观察及检测指标 给药后观察小鼠可能出现的毒性症状及死亡情况，观察指标包括小鼠活动状态、被毛、口腔、眼鼻分泌物、粪便、尿液、耳和呼吸频率等，后续每天上、下午分别观察至第14天，于给药后3、6、9、12、14 d固定时间测定体质量，于给药后3、6、9、12、15 d测定摄食量，对死亡小鼠及观察期结束依然存活的小鼠进行大体解剖观察，如发现肉眼可见异常可进行病理学检查[4-6]。

2.2亚急性毒性实验

2.2.1分组及给药 将大鼠按照性别和体质量随机分为阿如日-4味丸低、中、高剂量组(2.7、5.4、10.8 g·kg-1，分别相当于人临床拟用剂量的15、30、60倍)和对照组(5 g·L-1CMC-Na)，每组20只，雌雄各半，给药体积按照体质量计20 mL·kg-1，连续28 d。

2.2.2观察及检测指标 给药期间每周测量体质量及摄食量1次，并根据体质量调整给药体积，给药期间每天对大鼠进行外观、行为及活动观察并记录，连续28 d，于末次给药后禁食12 h，巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，进行血液学和血液生化学检测，血液学指标：白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞容积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数(PLT)、红细胞分布宽度(RDW-CV)、中性粒细胞比率(NEUT)、淋巴细胞百分比(LYMP)、单核细胞百分比(MONO)、嗜酸细胞绝对值(EO)、嗜碱细胞百分比(BASO)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)；血清生化指标:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(CRE)、血糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、三酰甘油(TG)、K+浓度、Na+浓度、Cl-浓度和Ca2+浓度；系统尸体解剖：对各脏器全面观察；主要脏器质量：心、肝、脾、肾、脑、肾上腺、甲状腺和胸腺等；组织病理学检查：肾上腺、主动脉、脑、盲肠、结肠、子宫和子宫颈、十二指肠、附睾、食管、眼、心脏、回肠、空肠、肾脏、肝脏、肺脏(附主支气管)、乳腺、卵巢和输卵管、胰腺、垂体、前列腺、直肠、坐骨神经、骨骼肌、皮肤、脾脏、胃、睾丸、胸腺(或胸腺区域)、甲状腺、气管及所有大体观察到异常的组织，用100 g·L-1甲醛固定，以备组织病理学检测[7-8]。

3 结果

3.1急性毒性实验检测结果

3.1.1一般状态观察 给予阿如日-4味丸当日上、下午观察，未见小鼠死亡，同时，小鼠外观、行为等均未出现异常；在随后14 d对阿如日-4味丸组和对照组动物进行一般状态观察发现，实验小鼠活动状态、被毛、口腔、眼鼻分泌物、粪便、尿液、耳和呼吸频率等均未出现异常；观察期结束对小鼠进行解剖观察，外观、皮下、胸腔、腹腔、心、肝、脾、肺、肾、脑和胃肠等脏器均未见明显异常。

3.1.2阿如日-4味丸对小鼠体质量及摄食量的影响 见表1、表2和表3。由表1、表2和表3可知，与对照组比较，阿如日-4味丸组各测量时间点体质量和摄食量差异均无统计学意义(P>0.05)，且各组小鼠体质量随时间的延长而增加。

表1 阿如日-4味丸对雌性小鼠体质量的影响

表2 阿如日-4味丸对雄性小鼠体质量的影响

表3 阿如日-4味丸对小鼠摄食量的影响

3.2亚急性毒性实验结果

3.2.1一般状态观察 每日给药后对大鼠进行观察，各组均未见大鼠死亡，与对照组比较，阿如日-4味丸低、中、高剂量组小鼠活动状态、行为、外观、口腔、眼鼻分泌物、粪便和尿液等均未见异常。给药结束后对大鼠进行解剖观察，外观、皮下、胸腔、腹腔、心、肝、脾、肺、肾、脑和胃肠等脏器均未检出肉眼可见异常。

3.2.2阿如日-4味丸对大鼠体质量及摄食量的影响 见表4、表5和表6。由表4、表5和表6可知，与对照组比较，阿如日-4味丸低、中、高剂量组同一测量时间点体质量和摄食量差异均无统计学意义(P>0.05)。

表4 阿如日-4味丸对雌性大鼠体质量的影响

表5 阿如日-4味丸对雄性大鼠体质量的影响

表6 阿如日-4味丸对大鼠摄食量的影响

3.2.3阿如日-4味丸对大鼠血清生化指标的影响 见表7和表8。由表7和表8可知，与对照组比较，阿如日-4味丸中剂量组雄性大鼠血清ALT和HDL升高、CRE降低(P<0.05)；阿如日-4味丸高剂量组雄性大鼠血清GLU降低(P<0.01)；阿如日-4味丸低剂量组雄性大鼠血清生化指标差异无统计学意义。与对照组比较，阿如日-4味丸高剂量组雌性大鼠的LDL降低(P<0.05)，其他各组雌性大鼠指标差异无统计学意义。

表7 雄性大鼠血清生化指标测定结果

表8 雌性大鼠血清生化指标测定结果

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

3.2.4阿如日-4味丸对大鼠血液学指标的影响 见表9和表10。由表9和表10可知，与对照组比较，阿如日-4味丸低剂量组雄性大鼠的MCH、MCHC均升高，APTT降低(P<0.05)；阿如日-4味丸中剂量组雄性大鼠的RBC降低(P<0.05)，MCV、MCH均升高(P<0.05)；阿如日-4味丸高剂量组雄性大鼠的EO升高(P<0.01)。与对照组比较，阿如日-4味丸低剂量组雌性大鼠的RBC、HGB、APTT均降低(P<0.05)，NEUT升高(P<0.05)；阿如日-4味丸中剂量组雌性大鼠的RDW-CV升高(P<0.05)，APTT降低(P<0.05)；阿如日-4味丸高剂量组雌性大鼠的RDW-SD升高(P<0.01)，HGB降低(P<0.01)。

表9 雄性大鼠血液学指标测定结果

表10 雌性大鼠血液学指标测定结果

3.2.5阿如日-4味丸对大鼠脏器湿质量的影响结果 见表11和表12。由表11可知，与对照组比较，阿如日-4味丸低剂量组雄性大鼠心、左肾(P<0.05)和肾上腺(P<0.01)湿质量降低；阿如日-4味丸高剂量组雄性大鼠左肾湿质量降低(P<0.05)。由表12可知，与对照组比较，阿如日-4味丸中剂量组雌性大鼠肝湿质量升高(P<0.05)。

表11 雄性大鼠脏器质量称量结果

表12 雌性大鼠脏器质量称量结果

4 讨论

阿如日-4味丸处方中制草乌所含生物碱类既是有效成分也是毒性成分[9]，临床使用不当会出现中毒现象，如恶心、呕吐，严重者会出现心率缓慢或节律紊乱，血压下降以致休克或死亡等症状[10]；细辛中主要化学成分有马兜铃酸、细辛脂素和挥发油等[11]，长期使用细辛可致呼吸毒性、肝肾毒性和遗传毒性等[12-13]，对其进行急性毒性评价具有重要意义。

阿如日-4味丸的成人临床服用剂量为每次2 g，每日1次，以70 kg成人标准体质量计算，临床拟用剂量为0.029 g·kg-1，急性毒性研究中，40 mL·kg-1为小鼠的最大给药剂量、300 mg·mL-1为最大给药质量浓度，约为人临床拟用剂量的414倍。根据重复给药相关指导原则，亚急性毒性研究剂量设计时，应保证暴露量不低于临床暴露量的50倍，为充分暴露毒性，设置阿如日-4味丸高、中、低剂量组(10.8、5.4、2.7 g·kg-1，约为人临床拟用剂量的60、30、15倍)。

这项研究用KM小鼠和SD大鼠进行了阿如日-4味丸急性和亚急性毒性实验。在急性毒性研究中，以最大给药量、最大给药体积给予阿如日-4味丸混悬液后，与对照组比较，阿如日-4味丸组小鼠行为、外观及活动状态等均未见异常，且未出现小鼠死亡，阿如日-4味丸组小鼠的体质量、摄食量与对照组比较差异均无统计学意义；观察期结束解剖小鼠，心、肝、脾、肺、肾、脑等主要脏器均未见明显异常，给予阿如日-4味丸的最大耐受剂量高于12 g·kg-1，约为临床拟用剂量的414倍，提示阿如日-4味丸临床应用安全可靠。

在28 d亚急性毒性研究中，各组大鼠连续给予阿如日-4味丸后，大鼠的一般状态观察未见异常，与对照组比较，各组大鼠体质量、摄食量差异均无统计学意义，提示阿如日-4味丸对大鼠体质量及摄食量无影响；虽然血液学指标(MCH、MCHC、APTT、RBC、RDW-CV、RDW-SD等)、血清生化指标(ALT、HDL、CRE、GLU、LDL)及脏器湿质量(心、左肾、肾上腺及肝)部分个别指标出现异常，但变化无量效关系且绝对值变化较小，因此认为无毒理学意义，出现上述情况的原因可能是由采血操作或仪器引起的误差。

综上所述，小鼠给予12 g·kg-1阿如日-4味丸是安全的，未引起明显的毒性或不良反应；连续28 d给予10.8 g·kg-1阿如日-4味丸对大鼠血清生化指标、血液学指标、体质量及摄食量等各项指标均未产生明显影响，提示阿如日-4味丸临床用药安全可靠。