丹参药渣的功能组分及体外抗氧化活性

郑艳萍，袁 琪，李伟东，金俊杰，李 霜

(1.江苏海昇药业有限公司，江苏 南京 210061；2.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800)

丹参(Salviamiltiorrhiza)是我国重要的传统中药，属于40种常用大宗中药材品种之一，在临床上广泛用于治疗心脑血管疾病。我国的山东、四川、陕西和河南等省份是丹参的主产区，其中山东、四川两省的丹参产量可达1.6万t[1]，预计全国丹参药材产量在2万t左右。丹参药材加工提取有效成分后，可产生万吨级的丹参药渣。近年来，针对中药渣的开发利用研究成为热点，包括生物炼制、食用菌栽培基质、双向发酵以及动物饲料添加剂等应用[2]。

丹参药材中主要含有脂溶性二萜醌类、丹参酮类和水溶性的酚酸类、黄酮类、三萜类和甾醇等成分。现代药理研究结果表明，丹参在多方面具有较强的抗氧化活性，在治疗活性氧诱发的心脑血管疾病方面具有显著的疗效[3]。因此，抗氧化活性可作为丹参药材品质的评价方法[4-5]。我国丹参中成药制备常采用水浸丹参,其水溶性浸出物和其他药物混合制成丹参中成药[6]。经水浸提加工后的丹参药渣中，仍存在部分脂溶性的功能物质未得到充分利用，导致丹参资源性的浪费[7]。因此，对丹参药渣开展功能组分和精深加工的研究，可以促进丹参药材物尽其用，提升综合经济效益。

本文中，笔者主要对水浸提后丹参药渣的“三大素”和丹参酮等脂溶性功能组分进行分析，考察丹参药渣的体外抗氧化活性，为丹参药渣的深度开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 丹参药渣

丹参经水浸提加工后的药渣，由江苏海昇药业有限公司提供，形态如图1所示。药渣粉碎过0.425 mm筛，烘干备用。

图1 丹参药渣形态Fig.1 Danshen residues after water-extracted

1.1.2 化学试剂

中药化学对照品丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIA-磺酸钠、隐丹参酮以及二氢丹参酮，四川维克奇生物科技有限公司。2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid，ABTS·)、1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH·)、邻二氮菲、铁氰化钾等试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 丹参药渣中纤维素、半纤维素、木质素组分检测

采用美国国家可再生能源实验室(NREL)方法对其处理后，用HPLC进行检测，最后计算药渣中纤维素、半纤维素及木质素的含量[8]。

1.2.2 丹参药渣中可溶性还原糖和蛋白质

称取药渣20 g/L，121 ℃保温20 min后抽滤，取滤液为待测样品。采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法测滤液中还原糖含量[9]，以葡萄糖制作标准曲线。采用Brandford法测药渣中水溶性蛋白的含量[10]，以牛血清蛋白制作标准曲线。

1.2.3 丹参药渣中丹参酮组分检测

药渣处理方法参照文献[11]，略有改动。取丹参药渣5 g于圆底烧瓶中，加入100 mL甲醇，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定，用甲醇补足损失量，取滤液，过0.45 μm有机膜，于4 ℃避光备用。

检测条件：色谱分离柱为 Amethyst C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，岛津公司LC-20AB型高效液相色谱(HPLC)仪及紫外检测器。检测波长为270 nm，流动相为体积分数80%甲醇，进样体积为10 μL，流速为1.0 mL/min，柱温为 30 ℃。

分别精密称取适量各种丹参酮标准品，用甲醇溶解，配制不同质量浓度5～50 mg/L的溶液，过0.45 μm有机膜避光保存备用。分别以丹参酮标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线。

1.2.4 丹参药渣体外抗氧化活性分析

丹参药渣水浸提物或乙醇浸提物的制备。取丹参药渣或灭菌处理后的丹参药渣(含水量65%，经121 ℃灭菌处理1 h)的样品，按干物质与所加蒸馏水或75%乙醇的质量比为1∶ 10来配料，称定质量， 60 ℃超声提取2 h后冷却，再称定质量，用蒸馏水或75%乙醇补足损失量，抽取滤液，过0.45 μm有机膜，于4 ℃避光备用。对水或醇提取物用蒸馏水进行体积比1∶ 20稀释后，进行抗氧化活性分析。

ABTS+·的清除。用蒸馏水配制含7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾的混合溶液，将溶液放置于25 ℃避光孵育12～16 h得ABTS+·溶液。使用时用蒸馏水将该溶液稀释至其在波长 734 nm处吸光度为 0.700±0.005，即得ABTS+·工作液。测量时取 0.1 mL受试物溶液，加入 3.9 mL ABTS+·工作液，混合摇匀后于25 ℃孵育6 min，测量其在波长 734 nm 处的吸光值，并计算清除率(以纯溶剂做空白对照)。

ABTS+·清除率=

(1-实验组吸光值/空白组吸光值)×100%

(1)

DPPH·的清除。将0.1 mmol/L的DPPH 溶于乙醇溶液，即为DPPH·溶液。测量时取 2.0 mL 受试物溶液，加入2.0 mL DPPH·溶液混合摇匀，于25 ℃避光孵育 30 min，测其在波长517 nm 处的吸光值，并计算清除率(以95%乙醇做空白对照)。

DPPH·清除率=

(1-实验组吸光值/空白组吸光值)×100%

(2)

总还原能力的测定。测量时取 2.5 mL 受试品溶液，加入 2.5 mL 磷酸缓冲液(0.2 mmol/L，pH 6.6)和 2.5 mL 1%(质量分数)铁氰化钾溶液混匀，置于50 ℃孵育 20 min，迅速冷却，迅速加入 2.5 mL 10%(质量分数)三氯乙酸溶液并混匀，在3 000 r/min下离心 10 min，取2.5 mL上清溶液，再加入 2.5 mL 纯水和 0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后测定其在波长700 nm 处的吸光值。吸光值越大，表示受试物的还原能力越强。

·OH的生成及清除。在 10 mL 试管中依次加入 1.5 mL 5 mmol/L的邻二氮菲溶液、3 mL 0.5 mol/L pH7.4 的磷酸缓冲液、1 mL 7.5 mmol/L的FeSO4后立即摇匀，迅速加入待测溶液 3 mL，1 mL 0.1%(质量分数)的H2O2，然后用蒸馏水将反应体系体积补充至10 mL，迅速摇匀，然后将混合溶液于37 ℃水浴锅保温60 min，测量其在波长510 nm处的吸光值。

·OH清除率(E)=(AS-A0)/(A1-A0)×100%

(3)

式中：AS为含样品及H2O2的反应体系吸光值，A1为蒸馏水代替样品及H2O2的反应体系吸光值，A0为蒸馏水代替样品的反应体系吸光值。

2 结果与讨论

2.1 丹参药渣中的“三大素”及可溶性还原糖、蛋白质组分

植物源的药渣中含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素、多糖、蛋白和多种微量元素。丹参药渣体量达万吨级，深入分析药渣组分中的纤维素、半纤维素和木质素等组分含量，有助于从生物炼制角度去探讨药渣的利用潜力。

采用美国国家可再生能源实验室(NREL)方法对丹参药渣的“三大素”组分进行了分析，并对药渣的可溶性还原糖和蛋白质进行了检测，结果如表1所示。由表1可知：丹参药渣中可溶性还原糖和蛋白质含量较低，难以作为微生物代谢的速效碳源或氮源。丹参药渣中的纤维素、半纤维素和木质素的占比分别为19.5%、20.8%和16.8%。值得关注的是，丹参药渣中的纤维素含量比玉米秸秆中的(37.3%)[12]显著偏低，使得通过纤维素酶解丹参药渣制备可发酵糖的可行性存在较大局限。半纤维素和木质素等组分可以较好地被白腐真菌利用[13]。因此，丹参药渣可用于白腐真菌的培养基质。

表1 丹参药渣的“三大素”及可溶性还原糖、蛋白质含量

2.2 丹参药渣中的丹参酮组分检测

丹参酮是丹参中的脂溶性松香烷型二萜类化合物，又称为总丹参酮，是丹参根部的主要提取物之一，具有广泛的药理作用，受到医药学家的高度关注[14]。采用水浸提工艺对丹参药材进行加工后，脂溶性的丹参酮组分仍残留在药渣中，并未得到充分利用。

5种丹参酮组分标准品的混合物HPLC图谱如图2所示，丹参药渣经醇提后的提取物HPLC检测图谱如图3所示。根据图2和图3计算各组分峰面积对应的含量，测得丹参药渣中的丹参酮各组分：二氢丹参酮0.47 mg/g、隐丹参酮0.61 mg/g、丹参酮I 1.44 mg/g、丹参酮IIA 2.38 mg/g、总丹参酮含量为4.90 mg/g。

图2 丹参酮混合标准品的HPLC图谱Fig.2 HPLC profile of tanshinone mixed standard

图3 丹参药渣乙醇提取物的HPLC图谱Fig.3 HPLC profile of ethanol extract from Danshen residue

丹参药材中丹参酮的含量除受到样品处理方式及检测精度影响外，还受到药材加工方式、药材品种来源及产地等影响。整理部分文献数据，各种丹参样品以及丹参药渣中丹参酮含量如表2所示。蓝天凤等[15]对10个药店的丹参药材取样分析了丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮和二氢丹参酮的含量，丹参酮量为2.89～7.80 mg(以1 g药渣计)。夏静等[16]分析了不同来源丹参品种在同一环境条件下栽培后的样品中丹参酮含量，对丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮进行了分析，总丹参酮含量为5.42～9.77 mg。戴新新等[7]检测了山东菏泽步长制药有限公司提供的丹参药渣固体废弃物中丹参酮的质量，其丹参酮总量为5.12 mg。本研究中，丹参药渣样品中的总丹参酮的质量为4.90 mg(以1 g药渣计)，与戴新新等[7]研究的结果相近。通过文献数据比较可知，丹参药渣中丹参酮组分主要为丹参酮IIA、丹参酮I和隐丹参酮，与丹参药材中的组分一致，且质量接近5 mg。综上，丹参药渣可作为一种丹参酮资源，具有进一步开发利用的价值。

表2 丹参药材及丹参药渣中的丹参酮含量

2.3 丹参药渣的体外抗氧化活性

丹参的抗氧化活性是丹参药材品质、药品质量等的重点参考因素。已有研究表明，丹参水溶性成分具有显著的抗氧化活性，也是丹参及其制剂治疗心脑血管疾病的作用基础[17]。水浸提后丹参药渣中仍残余相当可观的丹参酮等脂溶性功效组分，对丹参药渣的体外抗氧化活性研究有助于其应用开发。

李鹏等[18]研究了天士力集团复方丹参提取剩余物(丹参复方药渣)的水/醇提取物混合物的体外抗氧化活性，结果表明丹参药渣具有一定的体外抗氧化活性，为将其开发成动物抗氧化饲料保健品提供了理论依据。

以ABTS·清除、DPPH·清除、总还原能力测定以及·OH清除等为评价方法，将丹参药渣的水提取液和醇提取液分别进行了体外抗氧化活性研究，结果如表3所示。由表3可知，丹参药渣的乙醇提取物较水提取物具有更好的抗氧化活性。尤其值得关注的是，对丹参药渣进行高温(121 ℃)处理1 h后，水/醇提取物的抗氧化活性均显著降低。这一结果有两个方面的指导作用：一是丹参中的抗氧化活性物质不耐受高温，在提取处理过程中有必要关注高温对抗氧化活性物质的降效作用；二是以丹参药渣为培养基质进行“双向发酵”时，高温灭菌处理药渣后，菌质的抗氧化活性会有较大损失。

表3 丹参药渣水/醇提取物的体外抗氧化活性

3 结论

通过对水浸提加工后的丹参药渣进行组分分析和体外抗氧化活性研究，结论如下：①丹参药渣中木质素含量较高，可溶性还原糖及蛋白质含量低，适合做白腐真菌培养基质；②1 g丹参药渣中丹参酮总量达4.90 mg，可作为丹参酮资源；③丹参药渣的乙醇浸提物具有较好的抗氧化活性。