TRIM35通过介导EMT促进骨肉瘤细胞侵袭和迁移的作用机制研究

张 杰，王 磊,李宝莉

(1.延安大学医学院，陕西 延安 716000；2.延安大学附属医院关节外科，陕西 延安 716000)

骨肉瘤是最常见且侵袭性很强的骨恶性肿瘤，目前主要采用病灶消除术和术前、术后全身多药化疗进行联合治疗，可治愈60%～65%的患者，但是其治疗过程中的毒性及不良反应仍然无法预测[1-2]。骨肉瘤患者的发病受多种环境和遗传因素的复杂网络调控，从而导致对其发病机制认识不清楚。因此，对骨肉瘤分子发病机制的研究尤为重要。Tripartite motif-containing protein 35(TRIM35)属于三元基序家族蛋白成员之一，是具有高度保守结构域的蛋白质。TRIM35在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，有研究表明其在非小细胞肺癌组织中的高表达是导致患者预后较差的重要原因之一，而TRIM35过表达也能够对非小细胞肺癌细胞的生物学功能产生影响[3]。此外，另有研究表明TRIM35能够促进肝癌、红白血病的发生，然而在对宫颈癌的研究中TRIM35的过表达能够抑制HeLa细胞增殖、克隆形成[4-6]。目前，TRIM35在骨肉瘤中的作用尚不清楚，TRIM35与骨肉瘤关系的研究有重要意义。

本研究通过检测正常人骨组织与骨肉瘤组织中TRIM35的表达，在人骨肉瘤细胞143B与Saos-2沉默和过表达TRIM35后，检测上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程标志蛋白，观察其对骨肉瘤细胞的迁移、侵袭等细胞生物学行为的影响，可望更好地优化骨肉瘤患者的诊断与治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本收集 本研究从延安大学附属医院病理科共收集了64例骨肉瘤患者癌组织切片和30例正常人骨组织切片作为实验对照组。本次组织切片的使用获得了患者的书面知情同意，并且得到了延安大学附属医院人类伦理委员会的伦理批准。

1.1.2 细胞与试剂 人骨肉瘤细胞(143B、Saos-2)从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心购买，DMEM培养基和胎牛血清以及抗生素购买于澳大利亚PAA公司，siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司，过表达质粒载体购买于上海吉凯基因公司，TRIM35以及β-actin抗体均购自美国Abcam公司，转染试剂购买于法国Polyplus生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色法 将提前收集好的骨肉瘤组织切片和正常骨组织切片放置烘箱1 h后，并用脱蜡、脱水、微波预处理，封闭，并使用一级抗体(TRIM35)在4℃下孵育过夜。用二级抗体孵育切片，经显色，复染后用Leica Q550图像分析系统测定染色强度。

1.2.2 细胞培养与转染 用含有10%胎牛血清的DMEM培养基对骨肉瘤细胞株(143B、Saos-2)进行培养，置于37℃、5%CO2且湿化的培养箱中，在无菌生物安全柜隔天换液。根据转染试剂说明书，采用合适的转染体系进行siRNA和过表达质粒转染。

1.2.3 RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR 转染24 h后，首先用TRIzol裂解细胞，然后离心提取总RNA。在mRNA分析方面，根据逆转录试剂生产厂家的方法合成cDNA，并应用SYBR Green PCR MasterMix进行扩增cDNA来检测TRIM35在不同处理细胞株中的表达。TRIM35上引物序列为5＇-CATCGCCAAGCACAATCAGG-3′，下游序列为5＇-GCGTTTTCGGCTCTTGTGTT-3＇；GAPDH上游序列为5＇-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3＇，下游序列为5＇-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3＇。

1.2.4 Western blot 转染48 h后，利用RIPA裂解细胞，离心后收集上清液，采用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定后煮沸制样。用等量蛋白样品进行电泳，转膜，5%的脱脂牛奶封闭1 h，一抗室温孵育1 h，于4℃冰箱过夜。第二天，TBST洗涤后，用提前配制好的二抗在摇床上孵育1 h，再次TBST洗涤结束后，配制化学发光液进行曝光图像采集。

1.2.5 细胞划痕实验 在6孔板接种细胞，密度约为60%～70%进行转染，6 h后更换无血清培养基，用移液器吸嘴进行等宽度划痕。分别在0、24、48 h进行图像采集，分析TRIM35的低表达与高表达对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。

1.2.6 细胞Tanswell实验 在12孔板中接种细胞，待细胞密度为60%～70%进行转染，放置培养箱中培养。取24孔培养板放入小室，下室为0.6 mL 10%血清的培养基，上室为0.2 mL无血清培养基，分别接种5×104个细胞于上室中。隔天后，弃去培养基，PBS清洗，用4%多聚甲醛进行固定，用1%结晶紫进行染色，蒸馏水冲洗，最后用棉签擦去上室细胞，干燥后拍照计数。

1.2.7 统计学方法 用SPSS 25.0软件进行本次实验数据的统计分析。独立样本双侧t检验用于组间差异比较，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TRIM35在正常骨组织和骨肉瘤组织中的表达

本研究采用免疫组化方法对骨肉瘤组织及其正常骨组织中TRIM35的表达进行检测，与正常骨组织相比，TRIM35在骨肉瘤组织中表达显著升高(见图1)。

图1 在正常骨组织和骨肉瘤中TRIM35的表达情况

2.2 TRIM35特异性siRNA及过表达质粒载体的转染效率验证

本研究对TRIM35高表达的143B细胞进行转染siRNA及TRIM35低表达的Saos-2细胞进行转染过表达质粒载体。qRT-PCR与Western blot结果显示，在143B细胞转染siRNA后，蛋白与mRNA水平显著降低(P<0.05，见图2)；而在Saos-2细胞进行过表达载体转染后，蛋白与mRNA水平显著升高(P<0.05，见图3)。

图2 143B各组细胞中TRIM35的表达情况对比

图3 Saos-2各组细胞中TRIM35的表达情况对比

2.3 TRIM35对骨肉瘤细胞迁移能力的影响

沉默TRIM35的划痕实验结果显示，划痕后的24 h与48 h，143B-siTRIM35组的细胞迁移率都显著低于143B cell组和143B-siNC组(见图4)；过表达TRIM35的划痕结果显示，过表达TRIM35能够显著提高Sao-2细胞的迁移能力(见图5)。

图4 划痕实验检测143B各组细胞的迁移能力

图5 划痕实验检测Saos-2各组细胞的迁移能力

2.4 TRIM35对骨肉瘤细胞的侵袭能力的影响

143B细胞转染siRNA后，实验结果如图6显示，143B-siTRIM35组进入下室的细胞数显著低于143B cell组和143B-siNC组，而143B cell组和143B-siNC组之间未见明显差异；反之，在Sao-2细胞进行过表达TRIM35后，实验结果显示Saos-2-TRIM35组进入下室的细胞数显著高于Saos-2 cell组和Saos-2-NC组，而Saos-2 cell组和Saos-2-NC之间则未见明显差异(见图7)。

图6 TRIM25低表达后对143B细胞侵袭能力的影响

图7 TRIM25高表达后对Saos-2细胞侵袭能力的影响

2.5 TRIM35的沉默与过表达对EMT进程的标志性蛋白的影响

Western blot检测沉默TRIM35与过表达后的EMT进程中的标志性蛋白及调控EMT进程的关键转录因子的蛋白水平变化。如图8所示，TRIM35表达下调时，EMT进程标志蛋白均明显改变，这表明敲低TRIM35能够抑制143B细胞中的EMT进程；如图9所示，细胞中过表达TRIM35能够诱导EMT进程的发生。

图8 143B各组细胞中EMT相关指标蛋白的表达情况

3 讨论

骨肉瘤是一种原发性恶性骨肿瘤，最常见于儿童、青少年和二三十岁成人[7-8]。约15%～20%的患者在临床诊断时已经发生转移，超过85%的转移性疾病发生在肺部。本研究结果表明，TRIM35在骨肉瘤细胞的迁移与侵袭中有着重要的作用。在泛癌的研究中，研究者在57个肿瘤样本中发现TRIM35拷贝数的变化导致的基因突变与肿瘤发生相关信号途径有着密切的关联[9]。在肝癌的研究中，HBV-miR-2通过抑制细胞凋亡，促进细胞迁移和侵袭，促进EMT，从而促进肝癌细胞的生长，同时HBV-miR-2能抑制TRIM35的表达，TRIM35的异位表达可以抵消HBV-miR-2诱导的肝癌恶性表型[10]。在免疫系统中，TRIM35作为免疫细胞的感受器和乳腺癌发展中的癌基因，对乳腺癌患者的病情发展与预后有着重要的临床意义[11]。以上研究结果表明，TRIM35参与不同恶性肿瘤的发生发展过程。在我们的研究中，应用免疫组化技术检测TRIM35在骨肉瘤患者组织中呈现高表达；同时在骨肉瘤细胞中分别沉默和过表达TRIM35，并结合骨肉瘤细胞的划痕实验与Transwell实验发现其能够促进骨肉瘤细胞的迁移与侵袭的能力，表明TRIM35在骨肉瘤细胞运动中扮演着重要的角色。

EMT是上皮细胞获得间充质特征的过程。在癌症的研究中表明，EMT与肿瘤的发生、侵袭、转移和对治疗的抵抗均有着密切的关系，如不同状态的EMT与肿瘤细胞的增殖、可塑性、侵袭和转移等特征相关[12]。本研究的实验中检测了各组细胞中EMT相关指标的表达情况，包括E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等EMT进程的标志性蛋白及Zeb1和Snai1等调控EMT进程的关键转录因子。在143B细胞中下调TRIM35的表达时，E-cadherin的表达明显上调，而N-cadherin、Vimentin、Zeb1和Snai1等均明显下调，这表明TRIM35表达下调能够抑制143B细胞中的EMT进程；同时，在Saos-2细胞中上调TRIM35的表达，E-cadherin显著下调，而N-cadherin、Vimentin、Zeb1和Snail则又都显著上调，这说明在Saos-2细胞中过表达TRIM35能够诱导EMT进程的发生。

综上所述，TRIM35的上调可以促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，反之，下调则可抑制；同时TRIM35基因的高低表达变化能够引起EMT进程标志蛋白的改变，进一步影响EMT进程，这为后期研究TRIM35在骨肉瘤中的作用机制奠定了基础。