自闭基因Fmr1和MeCP2与GABA神经微环路调控

刘雪红，姜 鸣，3，4，杨清湖，3，4，王立欢，刘 霞，3，4*，白占涛，3，4*

(1.延安大学生命科学学院；2.多肽资源药物研究中心；3.延安市特色资源生物工程技术研究中心；4.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西 延安 716000)

神经环路是大脑神经系统的信息传递和处理的基础。大脑皮层中约80%的谷氨酸能锥体神经元释放兴奋性信号，20%中间神经元通过氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)发挥抑制作用[1]。虽然GABA神经元在大脑中占少数，但其决定兴奋抑制失衡的发生和发展窗口。因此，不同脑区GABA神经微环路组构是脑行为与神经环路信息的精准计算和处理基础之一。1943年Kanner首次提出自闭症(Autism Spectrum Disorder，ASD)的发育障碍疾病[2]，其核心症状包括社交障碍、语言障碍以及重复刻板行为和兴趣单一[3]。现已发现兴奋抑制(excitation/inhibition，E/I)失衡是自闭症患者大脑中的显然现象。自闭症具有很高的遗传性和异质性，涉及复杂的神经-免疫-内分泌和性别等多网络的整合，个体化发病机制较为普遍。迄今，自闭症数据库(AutDB)中收录了大约910个自闭症相关的基因[4]，伴X染色体相关的自闭基因有ATRX、CUL4B、DMD、Fmr1、HCFC1、IL1RAPL1、IQSEC2、KDM5C、MAOA、MeCP2、SLC9A6、SLC16A2和PHF8等[5]。虽然，自闭症遗传与环境发生机制仍存争议，但这些自闭相关基因的发现，仍为自闭症早期诊断和药物研发提供了不可替代的研究方向。本文聚焦于脆弱X综合征Fmr1基因、RTT综合征MeCP2基因，确定自闭基因与GABA神经网络的相关性，并构建Fmr1和MeCP2与GABA神经元的蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI)[6]，以期为基于GABA神经微环路的自闭症诊疗提供新思路。

1 GABA神经微环路与自闭症

GABA神经元在神经环路中发挥抑制作用[7]。中间神经元通过GABA能突触广泛地相互连接，形成GABA抑制性网络微环路。大脑GABA抑制性中间神经元可主要区分为小清蛋白(parvalbumin，PV)、生长抑素(somatostatin，SST)和血管活性肠肽(vasoactine intrestinal peptide，VIP)三类[8]。通过光遗传学分析发现，PV中间神经元对锥体神经元调控前馈抑制，并对于脑电伽马振荡至关重要[9]。SST中间神经元通过与附近锥体神经元的紧密连接提供局部神经元活动调控。VIP中间神经元则通过抑制SST中间神经元和少部分PV中间神经元，降低对后二者对锥体神经元的抑制作用，具有微环路的去抑制调控功能[10]。大量研究表明，自闭症是由于脑内E/I失衡引起，而GABA神经元是维持E/I平衡的关键因素，因此GABA神经微环路异常可能是自闭症产生的机制[11]。PV中间神经元在皮层E/I平衡中起到不可或缺的作用，而SST神经元在初级视觉皮层(Visual Cortex，V1)中没有维持E/I平衡的作用[12]。PV和SST中间神经元在抑制锥体神经元中的作用一致，这些中间神经元在癫痫动物模型中的功能降低。相反，减少VIP中间神经元的激活可以通过增强兴奋性神经元的抑制来减少癫痫发作[13]。精神分裂症(Schizophrenia，SCZ)小鼠模型中的PV神经元存在功能障碍，而PV和SST中间神经元功能障碍则见于阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)小鼠模型[14]。中间神经元功能障碍还与ASD和双相情感障碍(bipolar affective disorder，BD)相关[15]。VIP神经元抑制PV神经元的活性，从而兴奋锥体神经元，打破E/I平衡，诱致自闭障碍的发生。因此，调控GABA神经微环路可能是自闭症诊疗的神经修复基础。

2 Fmr1与脆性X综合征

脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是导致遗传性智能障碍和自闭症谱系障碍的主要原因之一。位于X染色体的Fmr1(FMRP translational regulator 1)基因沉默引起随后翻译的抑制因子脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)丢失，从而导致X连锁显性遗传的FXS[16]。Fmr1基因在Xq27.3上的5′非翻译区(CGG)n重复序列的异常扩增，导致启动子区甲基化并随后使该基因沉默，是FXS发病的主要机制。FXS的男性患病率为1∶4000，女性患病率为1∶8000[17]。FXS患者表现为社交障碍、自闭症谱系障碍、语言延迟、癫痫发作和异常睡眠模式及特征性外表变化[18]。Fmr1突变引起的失调症还有脆性X相关联的震颤/共济失调综合征(fragileX-associatedtremor/ataxiasyndrome,FXTAS)和脆性X相关的原发性卵巢不全(fragile X- associated primary ovary insufficiency,FXPOI)[19]。

3 MeCP2与RTT综合征

RTT综合征是一种严重影响儿童精神运动发育的疾病，患者呈进行性智力下降、典型自闭刻板动作及共济失调。甲基CpG结合蛋白2 (methyl-CpG- binding protein 2,MeCP2)是甲基DNA结合蛋白家族的成员之一，是一个双向转录调节因子，具有激活和抑制作用[20]。位于Xq28染色体上的MeCP2基因突变蛋白缺失是RTT的致病因素，年轻女性患病率为1∶10000，男性中报告的病例极少[21]。这种神经退行性疾病于1966年首次被提出[22]，从表面上正常的发育到6～18个月大之后，发育停滞，随后出现快速退化，导致严重的智力障碍、感觉处理异常、运动障碍、呼吸模式异常和癫痫等症状[23]。

4 Fmr1和MeCP2与GABA神经元

Fmr1和MeCP2在GABA神经元亚型中大量表达。Fmr1敲除(knockout,KO)小鼠的大脑皮层中MeCP2蛋白水平升高，而MeCP2 KO小鼠显示出FMRP蛋白水平降低，这暗示了MeCP2和FMRP活性之间存在相互作用[24]。同时,Fmr1和MeCP2与GABA神经元相关蛋白互作网络的STRING数据库预测分析，可确定存在几条GABA神经微环路的E/I平衡调控通路。

4.1 Fmr1与GABA神经元

大脑中的谷氨酸和GABA环路之间失衡常引发神经毒性，导致FXS中的氧化应激水平增高。大脑主要的GABA途径参与FXS患者的社交行为缺陷、睡眠障碍、焦虑和癫痫的发生[25]。兴奋性突触电路中代谢型谷氨酸受体1/5(metabotropic glutamate receptors1/5,mGluR1/5)信号的功能失调被认为是FXS的一种经典机制[26]。在FXS患者的海马和新皮质中，谷氨酸能神经元的功能失调增加了兴奋性，进而抑制GABA能神经元的活性[27]。FMRP广泛表达在GABA能神经元，参与正常中间神经元的成熟和功能调控[28-29]，而Fmr1敲除小鼠星形胶质细胞中GABA的水平降低，谷氨酸水平增加，表现出自闭样行为[30]，且Fmr1 KO小鼠大脑皮层PV神经元数目少于野生小鼠。研究报道，抑制基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)增强了神经细胞周围基质网(perineuronal nets,PNNs)的形成，同时增加了Fmr1 KO小鼠听觉皮层(auditory cortex,AC)中PV水平和酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B，TrkB)磷酸化，但降低了丝苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,AKT)磷酸化[31]，提示Fmr1可能通过调节PV神经元活性，改变TrkB /AKT磷酸化水平。此外，GABA信号传递紊乱，致使FXS患者的褪黑激素分泌和昼夜节律模式存在异常[32]。因此，Fmr1与GABA神经元功能活性调节密切相关。

4.2 MeCP2与GABA神经元

大脑皮层MeCP2在 GABA能神经元比非GABA能神经元中表达多50%[33]，表明MeCP2可能对GABA神经元更重要。缺少MeCP2的GABA能神经元表现出抑制功能的减弱，与谷氨酸脱羧酶1(glutamate decarboxylase 1,GAD1)和谷氨酸脱羧酶2(glutamate decarboxylase 2,GAD2)突触前减少和GABA免疫反应相一致[34]。MeCP2通过神经元阻遏因子-1沉默转录因子(repressor element silencing transcription factor,REST)调节KCC2 (potassium chloride cotransporter-20)表达，并最终控制神经元中的GABA功能[35]。GABA能神经元中缺失MeCP2，表现出社会行为、学习记忆、运动功能、刻板行为等多种神经精神病学表型[36]。在体感和运动皮层的Ⅱ/Ⅲ层中，4周和8周MeCP2 KO小鼠相比野生小鼠的PV神经元树突上兴奋性突触前突点的密度增加[37]。PV神经元中缺少MeCP2的小鼠出现了运动、感觉、记忆和社交缺陷，在SST神经元中敲除MeCP2的小鼠表现出癫痫发作和刻板行为[38]。MeCP2 KO小鼠PV细胞上突触结合蛋白-2(Synaptotagmin 2,Syt2)信号的减少和囊泡谷氨酸转运蛋白-2(vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2)信号的增加，使PV神经元之间的抑制输入减弱，而丘脑皮层对PV细胞的兴奋性输入增强。在出生后视皮层发育的关键时期，在PV细胞中敲除MeCP2消除了视觉依赖的可塑性，而SST细胞或谷氨酸能锥体细胞中MeCP2敲除则没有这种作用。在VIP神经元中条件性敲除MeCP2，小鼠不会增加癫痫发作或死亡率[39]，而VIP与社会认知缺陷相关[40]。VIP神经元数量在中央昼夜节律 (视交叉上核)中显著减少，MeCP2突变小鼠昼夜节律易紊乱，导致慢性时差，增加死亡率[41]。因此，GABA微环路功能相应与MeCP2的亚细胞差异直接相关。

4.3 Fmr1和MeCP2与SLC12A5

GABA激活GABAA受体，通过增加Cl-电导引起Cl-内流，使神经元发生超极化来抑制突触后神经元放电。GABA还可通过激活与K通道偶联的GABAB受体来抑制神经元的活动。Cl-内流来源于细胞内外的浓度梯度差，而此浓度梯度取决于特异性的氯离子转运体KCC2，它能将细胞内氯离子泵出细胞外，造成胞外高氯，从而维持GABAA受体的抑制性功能。溶质载体家族12A5基因 (Solute Carrier Family 12,Member 5,SLC12A5)编码KCC2。KCC2是GABA神经元主要的Cl-转运体，对神经递质GABA受体和甘氨酸受体具有抑制作用[42]。Na+-K+-2Cl-协同转运蛋白(Na+-K+-2Cl-combined transporter type 1,NKCC1)和KCC2作为GABA能传输的开关，从在GABA神经元从兴奋性到抑制性的发展转换过程中作为两个离子转运体来共同表达。GABA的去极化作用产生是由于NKCC1上调和KCC2下调共同决定的，这个过程参与多种皮质发育，如神经发生、迁移和突触发生，改变Cl-内稳态可能与神经发育障碍的发病机制有关。KCC2是决定MeCP2功能输出的关键下游信号分子。然而，在Fmr1敲除小鼠的发育阶段，均未发现NKCC1和KCC2的表达差异，表明在Fmr1敲除小鼠中观察到的GABAA受体改变与这些转运蛋白的表达变化无关[37]。在BDNF-TrkB通路中KCC2上调对脊髓损伤和康复起作用[43]。另外，利用PPI互作分析发现，SLC12A5与PV和SST有直接联系，与VIP有间接联系(见见图1)。由此推测，SLC12A5对在GABA环路中MeCP2通过SLC12A5表达调控而实现GABA微环路发育调节，与自闭障碍幼年多发的规律吻合。

4.4 Fmr1和MeCP2与PI3K-AKT-mTOR信号通路

PI3K-AKT-mTOR信号通路是胰岛素生长因子1(insulin-likegrowthfactor1,IGF1)激活的主要信号通路，参与细胞增殖、凋亡、代谢和血管生成[44]。这条信号通路由两部分组成：磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)及其下游分子磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphate idyli-nositol 3 k inase/serine-threon ine k inase,PI3K/AKT)[45]。该途径功能障碍不仅与肿瘤的发生和发展有关，而且与白血病、糖尿病、精神分裂症等多种人类疾病有关[46]。在RTT小鼠模型中，PI3K-AKT-mTOR信号传导途径和内源性胰岛素样生长因子(IGF-1)的表达均有所降低[47]。mGluR5激活PI3K-AKT-mTOR信号通路，而在Fmr1 KO小鼠和FXS患者中该通路中的关键蛋白质的活性均有少量增加。在mGluR5和Ⅰ型胰岛素样生长因子受体(Type 1 insulin-like growth factor receptor,IGF1R)参与的信号通路中的这种重叠作用表明，降低IGF1R的水平可能会抑制mGluR5激活所引起的Fmr1 KO小鼠中无节制的翻译过程[42]。基此推测，MeCP2可以通过Fmr1在PI3K-AKT-mTOR起作用，并且与STT有直接作用，而对PV和VIP通过SST或BDNF有间接作用(见图1)。

图1 Fmr1和MeCP2与GABA神经元蛋白网络

4.5 Fmr1和MeCP2与MMP-9

MMP-9是一种细胞外存在的Zn2+依赖性肽链内切酶，响应于谷氨酸的释放，从而增强神经元活性，在神经元中表达，并在树突处局部翻译和释放。MMP-9在发育过程中建立突触连接和重组大脑中的突触网络中都发挥着重要作用[48]。在成年Fmr1 KO小鼠的听觉皮层中MMP-9高表达，通过敲除MMP-9基因能够逆转Fmr1 KO小鼠的听觉超敏性缺陷[49]。Fmr1 KO小鼠海马中用抗生素米诺环素治疗后MMP-9活性降低，观察到Fmr1 KO小鼠的树突棘成熟，焦虑改善和增强探索行为[50]。MeCP2抗体的芯片分析显示使用甲基汞处理过的动物中MMP-9启动子水平较低，进一步验证了MMP-9基因启动子甲基化缺失[51]。由PPI网络分析发现，MMP-9与Fmr1和MeCP2是间接联系的(见图1)。MMP-9可能是FXS和RTT治疗中潜在的生物标志物。

4.6 Fmr1和MeCP2与BDNF

BDNF参与正常神经回路功能和发育过程的调节，GABA能神经元和突触成熟的发育过程中需要BDNF。miR-132抑制MeCP2的翻译并随后降低BDNF的表达。相反，BDNF诱导miR-132表达，下调MeCP2，形成体内平衡机制[52]。MeCP2敲低和过表达均增强了培养海马神经元的BDNF蛋白水平[53]。这些发现表明，MeCP2对BDNF表达的控制具有双重作用。Fmr1 KO小鼠的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)-TrkB信号传导失调会导致大脑发育改变，包括过度海绵化[54]。BDNF作为Fmr1和MeCP2连接VIP和SST的中心因素，在传递过渡性信号中起重要作用(见图1)。

5 结语

本文梳理了自闭基因Fmr1和MeCP2在不同类型GABA神经元中的表达，探明二者与GABA神经微环路的兴奋/抑制平衡调控机制，构建了Fmr1和MeCP2与GABA神经元的关键蛋白功能互作网络，明确了Fmr1和MeCP2通过BDNF直接调控VIP，SST间接调控PV的分子路径，为基于GABA抑制性神经网络微环路的自闭症诊疗新策略的发现，提供了新思路。随着自闭基因与GABA能神经网络微环路、兴奋/抑制稳态平衡的全脑空间发育图谱的深入研究，有望解开自闭症相关基因与PV、VIP和SST抑制性GABA神经元的差异表达调控机制，为自闭症等神经发育相关障碍性疾病的防治带来新的希望。