藁本内酯抑制RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化及其与GPER相关机制

崔杰，李梦雨，刘雨彤，毛洪运，林紫微，杨菲，华永庆,3

(1.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;3.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京 210023)

骨质疏松症(OP)是一种全身性骨代谢疾病，主要表现为骨量降低，进而导致骨折风险增加。我国65岁以上人群OP患病率达到32%，其中女性患病率高达51.6%[1]。骨代谢平衡是维持骨量的重要前提。在OP发生早期阶段，破骨细胞的过度激活干扰了成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，是造成骨丢失并导致OP最关键的原因。目前靶向破骨细胞分化是预防OP的主要治疗策略[2]，临床上的代表性药物主要是双磷酸盐类、雌激素类等，但长期使用易引起颌骨坏死、非典型骨折等严重副作用[3]。

中医药治疗OP具有疗效确切，不良反应少等独特优势[4]。当归是中医药治疗OP最常用的药物之一[5],具有补血活血、调经止痛等功效。藁本内酯(LIG)是当归中最主要活性成分之一，在其挥发油中含量可达45%～70%[6]。我们前期研究发现，LIG可通过G蛋白偶联雌激素受体(GPER)信号通路促进成骨细胞分化，发挥骨保护作用[7]。本文旨在观察LIG对破骨细胞形成及分化的影响，并进一步探讨其与GPER相关的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂

RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库；藁本内酯(上海源叶生物有限公司，批号：ZT-71536，纯度：98%)；17β-雌二醇(E2，Sigma公司，批号：E8875)；RANKL(近岸蛋白质科技有限公司，批号：CR06)；G36[爱必信(上海)生物科技有限公司，批号：MA27]；Trizol、逆转录试剂盒、扩增试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，批号：R401-01，R223-01-AB，Q111-02-AA)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0332)；TRAP染色试剂盒(Sigma公司，批号：387A-1KT)；FITC标记鬼笔环肽(上海翊圣生物科技有限公司，批号：40735ES75)；BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0011)；GPER抗体(Abcam公司，批号：ab39742)；GAPDH(武汉三鹰生物技术有限公司，批号：10494-1-AP)。

1.2 主要仪器

酶标仪(型号：SyneRgy2，Bio-Tek公司)、定量病理成像分析系统(型号：Mantra，PerkinElmer公司)、活细胞工作站(型号：AXIO vert A1，ZEISS公司)、实时荧光定量PCR仪(型号：7500，Applied Biosystems公司)、体视荧光显微镜(型号：M205FA，Leica公司)、生化培养箱(型号：SPX-150，上海跃进医疗器械有限公司)、数字化凝胶成像工作站(型号：ChmiDoc RS+，BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 细胞培养

RAW264.7细胞用含10%热灭活胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中进行培养。隔天换液，当细胞长至85%左右时，进行传代。

2.2 MTT法检测细胞活性

取生长状态良好的RAW264.7细胞按每孔4×103个接种到96孔板中，每孔含200 μL培养液。24 h后分组给药，每组给予50 ng/mL RANKL和不同浓度LIG(1、5、10、25、50、100、200 μmol/L)，每组设置5个复孔。按分组情况加入含相应药物浓度的DMEM培养液200 μL，4 d后弃去孔内培养液，每孔加入10 μL(5 g/L)的MTT溶液和100 μL不含血清的DMEM培养基。继续培养4 h后，弃去培养上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡器上振荡10 min。设定酶标仪波长为490 nm，记录吸光度值，计算细胞活性。

2.3 比色法检测TRAP活性

RAW264.7细胞按2.5×104cm-2接种到24孔板中，24 h后分组如下：对照组，RANKL组(50 ng/mL)，LIG组(0.1、1、10、25、50 μmol/L)。每组设置6个复孔。隔天换液，4 d后收集细胞裂解液上清，依次加入酒石酸溶液和显色底物，37 ℃孵育30 min，每孔加入160 μL反应终止液终止反应，使用酶标仪检测405 nm波长处的吸光度值。

2.4 TRAP染色

取生长状态良好的RAW264.7细胞接种到24孔板中，每孔含500 μL DMEM培养液。24 h后分组如下：对照组，RANKL组(50 ng/mL)，E2组(100 nmol/L)，LIG组(0.1、1、10 μmol/L)。每组设置4个复孔。隔天换液，4 d后，弃去孔内培养液，PBS清洗2次，固定液室温固定5 min，三蒸水清洗，TRAP染液37 ℃水浴锅内孵育1 h，三蒸水洗涤，室温晾干，甘油封片，镜下观察，选取细胞核≥3个的TRAP阳性细胞视为破骨细胞，进行计数。

2.5 qPCR检测破骨标志基因水平

RAW264.7细胞按2×105cm-2接种到12孔板中，24 h后分组如下：对照组，RANKL组(50 ng/mL)，E2组(100 nmol/L)，LIG组(0.1、1、10 μmol/L)。连续给药干预4 d后检测。每孔加入Trizol，分离和纯化总RNA并测定各组RNA浓度。每组设3个复孔，以GAPDH为内参，计算复孔Ct平均值，按照2-ΔΔCt计算得到相对定量结果。序列如下表1。

2.6 Western blot分析

RAW264.7细胞按2×105cm-2接种到12孔板中，24 h后分组如下：对照组，RANKL组(50 ng/mL)，E2组(100 nmol/L)，LIG组(0.1、1、10 μmol/L)。连续给药干预4 d后检测。每孔PBS清洗2次，按照BCA法蛋白提取试剂盒说明书进行处理。Western blot法在恒流40 mA的条件下电泳70 min，恒压100 V的条件下转膜90 min，5%BSA封闭1 h，4 ℃过夜孵育一抗，二抗室温孵育1 h，检测GPER的蛋白表达，并选取GAPDH作为内参。实验重复3次，Image J进行灰度值分析。

2.7 GPER拮抗剂G36对LIG效应的影响

2.7.1 TRAP活性检测、TRAP染色以及qPCR检测 RAW264.7细胞接种到孔板中。24 h后分组如下：对照组、RANKL组(50 ng/mL)、LIG(10 μmol/L)组、LIG(10 μmol/L)+G36(100 nmol/L)组。连续给药干预4 d后，进行TRAP活性检测、TRAP染色以及破骨标志基因的qPCR检测。

2.7.2 鬼笔环肽荧光染色 RAW264.7细胞按2.5×104cm-2接种到12孔板中。24 h后分组如下：对照组、RANKL组(50 ng/mL)、LIG(10 μmol/L)组、LIG(10 μmol/L)+G36(100 nmol/L)组。每组3个复孔，隔天换液。连续给药干预6 d后，吸去上清，用4%甲醛溶液固定10 min，PBS清洗，0.5%Triton X-100溶液透化处理5 min，用FITC-鬼笔环肽在室温下避光染色30 min，再用DAPI室温避光染色5 min，活细胞工作站下进行荧光拍照观察，并对具有完整F-actin环结构的破骨细胞进行计数。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 LIG对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响

结果显示，LIG的IC50为120.8 μmol/L(113～129.8 μmol/L)，LIG在浓度不高于10 μmol/L时，对RANKL诱导的RAW264.7细胞活性无影响。因此我们采用浓度不高于10 μmol/L的LIG进行后续研究。结果见图1。

TRAP是破骨细胞分化和活化的标志物，TRAP活性检测结果显示，与对照组相比，RANKL组TRAP活性升高(P<0.05)，而LIG在10 μmol/L时可显著降低破骨细胞TRAP活性(P<0.01)，结果见图2。TRAP染色结果显示，RAW264.7细胞在RANKL诱导下，TRAP阳性细胞率显著增多(P<0.001)，与RANKL组相比，10 μmol/L LIG组TRAP阳性细胞率显著减少(P<0.001)，结果见图3。以上结果均表明10 μmol/L LIG能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。

图1 LIG对RANKL诱导的破骨细胞活性的影响

3.2 LIG对RANKL诱导的破骨细胞特异性标志基因表达的影响

与对照组相比，RAW264.7细胞在RANKL诱导下，破骨细胞特异性标志基因DC-STAMP、NFATc1、CTSK、RANK mRNA表达均上升(P<0.001)；给予LIG后，以上各基因的表达均降低(P<0.05,P<0.001)，结果见图4。上述研究结果表明，LIG可抑制破骨细胞特异性基因的表达。

注：与对照组比较，###P<0.001；与RANKL组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。¯图4 LIG对RANKL诱导的破骨细胞标志性基因DC-STAMP、NFATc1、CTSK、RANK mRNA表达的影响

3.3 LIG促进破骨细胞GPER的表达

与对照组相比，RAW264.7细胞在RANKL诱导下，GPER的蛋白表达和mRNA水平均显著降低(P<0.01，P<0.001)。与RANKL组相比，给予不同浓度LIG后，GPER的蛋白表达和mRNA水平均升高，且LIG在10 μmol/L时有显著差异(P<0.001)，结果见图5～6。上述研究表明，LIG抑制破骨细胞形成作用可能是通过提高GPER水平引起的。

注：与对照组比较，###P<0.001；与RANKL组比较，***P<0.001。¯

注：与对照组比较，##P<0.01；与RANKL组比较，***P<0.001。¯

3.4 G36逆转LIG抑制RANKL诱导的TRAP阳性细胞形成

为证实GPER与LIG抑制破骨细胞生成的相关性，我们观察了GPER特异性拮抗剂G36干预后LIG效应的变化。TRAP染色结果显示，与LIG组相比，LIG+G36组TRAP阳性细胞数显著增加(P<0.01)，结果见图7。TRAP活性检测显示，与LIG组相比，LIG+G36组破骨细胞TRAP活性显著升高(P<0.05)，结果见图8。上述研究表明，LIG抑制破骨细胞形成作用与GPER有关。

注：与对照组比较，###P<0.001；与RANKL组比较，***P<0.001；与LIG组比较，&&P<0.01。¯比例尺=100 μm。

注：与对照组比较，###P<0.001；与RANKL组比较，**P<0.01；与LIG组比较，&P<0.05。¯图8 G36干预下LIG对RANKL诱导的破骨细胞TRAP活性表达的影响

3.5 G36逆转LIG抑制破骨细胞特异性标志基因的表达

与LIG组相比，给予G36后，破骨细胞特异性标志基因DC-STAMP、NFATc1、CTSK、RANK mRNA的表达均升高(P<0.05)，结果见图9。上述研究表明，LIG降低破骨细胞相关基因DC-STAMP、NFATc1、CTSK、RANK mRNA表达的作用与GPER有关。

注：与对照组比较，##P<0.01,###P<0.001；与RANKL组比较，*P<0.05,**P<0.01；与LIG组比较，&P<0.05。¯图9 G36干预下LIG对RANKL诱导的破骨细胞标志性基因表达的影响

3.6 G36逆转LIG抑制破骨细胞F-actin环的形成

F-actin环的形成是成熟破骨细胞特有标志，对破骨细胞骨吸收功能至关重要。鬼笔环肽荧光染色结果显示，RAW264.7细胞在RANKL诱导下向破骨细胞分化，可见完整清晰的F-actin环结构(P<0.001)；与RANKL组相比，10 μmol/L LIG可显著抑制破骨细胞F-actin环的形成(P<0.01)；给予G36后破骨细胞F-actin环形成明显增多(P<0.05)，结果见图10。上述研究表明，LIG抑制破骨细胞F-actin环形成，减弱破骨细胞骨吸收功能的作用与GPER有关。

注：与对照组比较，###P<0.001；与RANKL组比较，**P<0.01；与LIG组比较，&P<0.05。比例尺=100 μm。图10 G36干预下LIG对RANKL诱导的破骨细胞F-actin环形成的影响

4 讨论

雌激素在骨代谢中发挥重要的生理作用。绝经后女性体内雌激素水平大幅下降，骨吸收明显增加，导致骨量大量流失[8]。临床上曾用雌激素替代疗法有效防治OP[9]，但同时也引发了乳腺及子宫内膜增生，甚至引发肿瘤，如卵巢癌[10]等不良反应。如何在防治OP的同时，减少对其它组织器官的不良影响成为目前研究热点。GPER作为新型膜雌激素受体，广泛表达于中枢神经系统、内分泌及生殖系统、免疫系统、循环系统等[11]。与经典的核雌激素受体不同，GPER作为膜雌激素受体可直接与E2结合，产生快速效应，绝大多数情况下不通过影响细胞核发挥作用，因此又被称为非基因组信号通路[12-13]。GPER在骨组织中高表达，推测其可能介导了雌激素维持骨密度的作用[14]。GPER敲除后大鼠骨小梁显著减少，破骨细胞数量明显增多[15]，骨骼生长被显著抑制，且大鼠子宫质量未受影响[16]。高选择性的GPER激动剂G1激活GPER后可抑制破骨细胞分化[17]，同时显著增加去势大鼠骨矿含量及骨密度，并可避免雌二醇对子宫产生不良影响[18]。上述研究均表明激活GPER在骨保护中发挥重要的作用，并且对生殖系统刺激较小，可能具有较少的不良反应。

研究发现LIG可抑制骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化，该作用可能与RANK受体有关[19]。RANK是调节破骨细胞分化和骨吸收功能的关键因子，通过与RANKL结合，促进下游转录因子NFATc1的表达，从而影响骨吸收相关酶如TRAP和CTSK的表达[20]。本研究通过RANKL诱导RAW264.7细胞分化模型，经TRAP染色,TRAP活性及DC-STAMP、NFATc1、CTSK、RANK mRNA表达水平的检测，验证了LIG对破骨细胞分化的干预作用，并证实LIG抑制破骨细胞分化作用与RANK有关。

近年来，GPER在骨稳态中的调控日益受到重视，而基于GPER探讨中医药调控破骨细胞分化的机制研究仍然较少。本研究发现LIG可促进GPER的mRNA和蛋白的表达，提示LIG抑制破骨细胞分化作用可能与上调GPER有关。加入G36阻断GPER后可显著逆转LIG的作用。上述研究证实，LIG可通过促进GPER表达，减少RANK表达，从而影响下游转录因子NFATc1的表达及骨吸收相关酶的活性，抑制破骨细胞分化。LIG通过GPER发挥抗骨吸收作用可能是其产生骨保护作用的重要机制之一。

来源于植物中的植物雌激素(PE)，具有弱雌激素样活性，被证实具有骨保护作用，并不会产生对乳腺和子宫内膜的过度刺激，在防治肿瘤、心脑血管疾病和骨保护等方面具有广阔的应用前景[21-22]。PE种类繁多，按化学结构主要分为异黄酮类，木脂素类，香豆素类，二苯乙烯类及其他类(如人参皂苷、丹参酮ⅡA等)。最新研究表明，PE代表性成分淫羊藿苷被证实为有效的GPER激动剂[23]。而LIG为苯酞类化合物，具有不同于传统认识的PE类结构类型，其是否通过类似于PE的途径发挥作用值得关注。前期研究表明，LIG对成骨细胞的保护作用仅与GPER有关，而不是nER或ER-α36[7]。因此，无论在成骨细胞还是破骨细胞中，LIG均有利于骨质疏松病理改变时骨代谢平衡的修复，其独特的结构及活性特点可为寻找新的OP治疗药物提供线索。