朱琏抑制Ⅱ型针法对多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗大鼠IRS-1、IRS-2蛋白的影响

赵晓君，黄丽琳，麦威，贺彩，范郁山

(广西中医药大学针灸推拿学院，广西 南宁 530000)

多囊卵巢综合征(PCOS)是最常见的生殖内分泌疾病之一。PCOS患者除了伴有生殖功能障碍，还存在糖代谢异常的问题，主要表现为胰岛素抵抗(IR)和高胰岛素血症(HI)，50%～70% PCOS患者存在IR[1]。近年来，有关PCOS与IR的研究证实，IR是PCOS病理生理变化的关键环节，卵巢组织细胞增生及能量代谢异常可能与胰岛素受体底物-1(IRS-1)和胰岛素受体底物-2(IRS-2)的表达异常有关[2-3]。

目前PCOS的治疗越来越重视对IR的改善，临床上主要运用炔雌醇环丙孕酮联合二甲双胍纠正内分泌及糖代谢紊乱[4-5]，但炔雌醇环丙孕酮与二甲双胍易引起肝肾功能损害及胃肠道不良反应[6]，不适合患者长期服用。针刺治疗可有效改善PCOS糖脂代谢紊乱，且不良反应小[7]。朱琏抑制Ⅱ型针法是近代针灸学家朱琏创立的，主要用于运动、感觉、分泌机能亢进等疾病，通过激发和调整神经机能，协调各系统平衡，达到治病目的[8-9]。朱琏抑制Ⅱ型针法在痛证方面的应用和研究相对较多，在内分泌及代谢方面的研究相对较少。近年来，有学者运用朱琏抑制Ⅱ型针法治疗妇科疾病，取得一定疗效[10]，但缺少分子机制层面的研究。本研究旨在通过分析朱琏抑制Ⅱ型针法对PCOS-IR模型大鼠糖代谢的影响，探讨该针法改善PCOS-IR的作用机制，以期为朱琏抑制Ⅱ型针法的临床应用及PCOS防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄健康SPF级SD雌性大鼠40只，未孕，体质量(200±20)g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002，饲养于广西中医药大学实验动物中心，相关研究通过广西中医药大学伦理委员会的审查(审查证书编号:DW20190610-39)。

1.2 药物与主要试剂

来曲唑片(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：191016KG);炔雌醇环丙孕酮片(拜耳医药保健有限公司，批号：KT04L5J);盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，批号：ABH5489);大鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司，批号：JYM0620Ra);EDTA抗原修复液、封闭山羊血清、1×PBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，批号：20200717、SL038、P1020)；DAB染色液(福州迈新生物技术开发有限公司，批号：2009072031F)；苏木精染液(南昌雨露实验器材有限公司，批号：191202)；高效RIPA组织/细胞裂解液、蛋白酶抑制剂混合液、兔抗IRS-1一抗试剂盒、兔抗IRS-2一抗试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：R0010、P6730、K001623P、K005574P);兔抗β-actin一抗试剂盒(白鲨生物科技有限公司，批号：BL005B);羊抗兔二抗试剂盒(英国Abcam公司，批号：ab6721)。

1.3 主要仪器

华佗牌针灸针(0.25 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司)；血糖仪、血糖仪试纸(三诺生物传感股份有限公司)；普通离心机(TD4，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；4度离心机(5418R，德国Eppendorf)；恒温培养箱(DHP-90052，上海申贤恒温设备厂)；光学显微镜(BX-53；日本Olymplus)；多功能荧光酶标仪(FilterMax F3，美国MD)；电泳仪(PowerPac Basic，美国Bio-Rad)；蛋白转印模块(Mini Trans-Blot Cell，美国Bio-Rad)；凝胶成像系统(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)。

1.4 模型制备

40只SD雌性大鼠，适应性喂养1周,随机分为空白组、模型组、针刺组、西药组，每组10只。造模方法采用来曲唑(0.1 g/L 1%羧甲基纤维素溶液)1 mg/(kg·d)灌胃[11-12]，同时给予高脂饲料喂养，连续灌胃30 d；空白组大鼠予普通饲料喂养，每日予等量的1%羧甲基纤维素溶液灌胃。造模结束后，各组大鼠均予普通饲料喂养。造模第20天开始观察大鼠阴道脱落细胞变化情况，连续观察10 d。阴道脱落细胞涂片采用巴氏染色,显微镜下观察判断：动情间期可见大量白细胞；动情前期镜下视野以有核上皮细胞为主，散在少量角化细胞；动情期以无核角化细胞为主，间有少量有核细胞和白细胞；动情后期有核细胞、角化细胞及白细胞比例相当。

1.5 干预处理

空白组与模型组不采取任何治疗，在其他组实验时仅抓取、固定；西药组参照人和大鼠体表面积折算的等效剂量给药，炔雌醇环丙孕酮片给药量为0.18 mg/(kg·d)，二甲双胍给药量为135 mg/(kg·d)，连续灌胃28 d；针刺组采用朱琏抑制Ⅱ型针法治疗，用75%乙醇棉球局部消毒，使用0.25 mm×25 mm毫针，缓慢捻进针法进针，右手拇指、食指和中指执针柄，持针者平肘、举腕和抬手，力量重心在腕部，持针针尖距离皮肤稍近，与皮肤保持垂直，手指微微用力，原地慢慢捻动针柄，捻动几次稍停，然后再捻，针下有如鱼吞钩感后留针30 min，每隔10 min施以均匀平和捻转30 s的行针手法(均匀平和捻转，来回捻转的角度、频率相等，指力均匀，速度适中，捻转角度在90°～180°之间)，最后轻微捻动针柄取针[8,13]。取穴：关元、归来(双侧)、足三里(双侧)、三阴交(双侧)、丰隆(双侧)，定位参考华兴邦等《实验动物穴位图谱》[14]，每日1次，连续干预28 d。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 IR水平 末次治疗后大鼠禁食不禁水12 h，经断尾采血法测定空腹血糖(FBG)后，采用10%水合氯醛(每100 g体质量小鼠给予0.3 mL)腹腔注射麻醉，腹主动脉采血5 mL，4 ℃，2 000 r/min离心20 min，采集上清液置于-80 ℃冰箱保存待测，并剪取2块卵巢组织，1块用4%多聚甲醛固定用于免疫组化检测，另1块置于液氮中保存用于蛋白检测。指标检测前将血清样本放置4 ℃冰箱解冻，采用ELISA法检测空腹胰岛素(FINS)水平，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)采用稳态模型评估法：HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.6.2 免疫组化法检测卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白的定位表达 卵巢组织经包埋，切片(厚度4 μm)，脱蜡，EDTA抗原修复，切片浸泡在3%双氧水中室温孵育10 min，PBS洗3次，每次2～5 min，滴加5%正常山羊血清封闭，滴加稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，滴加稀释的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树脂封片。将组织切片置于40×镜下观察，棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，使用Image-Pro Plus 6软件进行图像分析，每张切片随机选取5个视野，测定IRS-1、IRS-2阳性染色面积和积分光密度，算出平均光密度值。

1.6.3 Western blot法检测卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白的相对表达量 取液氮保存的一块卵巢，把卵巢组织剪成细小碎片，取20～40 mg放入2 mL离心管置于冰盒上，加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂的混合物(RIPA-PMSF)，用匀浆机匀浆至无沉淀，提取出组织总蛋白。采用BCA法测定蛋白含量。根据蛋白浓度加入上样缓冲液，100 ℃变性10 min，电泳，转膜，用缓冲液(TBST)配制8%脱脂奶粉作为封闭液，将膜放入封闭液中封闭3 h。按抗体说明书上的推荐比例使用封闭液将一抗进行稀释，将膜放入稀释后的一抗中4 ℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST洗膜3次，每次15 min。将膜放入按1∶4 000比例稀释的山羊抗兔二抗中,37 ℃孵育1 h，使用TBST洗膜3次，每次15 min。采用ECL显色剂对膜进行显色，于凝胶成像仪中进行曝光成像，并测定条带灰度值，计算目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的相对表达量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 造模后各组大鼠阴道脱落细胞情况

空白组大鼠阴道涂片按照动情间期、动情前期、动情期、动情后期规律变化，见图1；造模大鼠(模型组、针刺组、西药组)阴道涂片以大量白细胞为主，动情间期延长，动情周期紊乱，说明造模成功，见图2。

注：红色箭头所示为白细胞；黑色箭头所示为上皮细胞；黄色箭头所示为角化细胞。图1 空白组大鼠阴道脱落细胞情况(×40)

注：红色箭头所示为白细胞。图2 模型组、针刺组、西药组大鼠阴道脱落细胞情况(×40)

2.1 各组大鼠FBG、FINS水平及HOMA-IR比较

各组FBG比较，差异均无统计学意义。与空白组比较，模型组大鼠FINS水平及HOMA-IR值显著升高(P<0.05)。与模型组比较，针刺组和西药组大鼠FINS水平及HOMA-IR值显著降低(P<0.05)。针刺组和西药组比较，差异无统计学意义。见图3。

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，图3 各组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的比较

2.2 各组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白的定位表达

免疫组化染色结果显示：IRS-1、IRS-2在卵巢间质细胞、颗粒细胞、初级卵母细胞中均有表达。卵巢间质细胞染色较浅，呈黄色；颗粒细胞染色呈棕色；初级卵母细胞染色较深，呈棕褐色。空白组IRS-1、IRS-2蛋白阳性表达呈棕褐色，且染色深。模型组IRS-1、IRS-2蛋白阳性表达较空白组染色浅，且IRS-2蛋白阳性表达较IRS-1蛋白染色浅；针刺组和西药组IRS-1、IRS-2蛋白在卵巢间质细胞、颗粒细胞、初级卵母细胞中均有不同程度的阳性表达，且IRS-2蛋白阳性表达较IRS-1蛋白染色稍浅。见图4～5。

图4 免疫组化法检测各组大鼠卵巢组织IRS-1表达(×400)

免疫组化平均光密度结果显示：与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织中IRS-1、IRS-2平均光密度显著降低(P<0.05)；与模型组比较，针刺组、西药组IRS-1、IRS-2平均光密度显著升高(P<0.05)；针刺组和西药组比较，差异无统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2的平均光密度比较

2.3 各组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白表达比较

与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织中IRS-1、IRS-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与模型组比较，针刺组、西药组IRS-1、IRS-2蛋白表达显著升高(P<0.05)；针刺组和西药组比较，差异无统计学意义。见图6。

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，图6 各组大鼠卵巢组织IRS-1、IRS-2蛋白表达比较

3 讨论

中医学理论将PCOS归纳于“闭经”“不孕”“癥瘕”等范畴，其发病多与肾、脾、肝关系密切，以肾虚、脾虚为主，加之痰湿、瘀血等病理产物壅滞胞宫胞脉，导致冲任气血失调而致本病。因此，针灸治疗应以补益脾肾、调理冲任治其本，化痰通络治其标。本实验选关元穴，双侧归来、足三里、三阴交及丰隆穴。关元穴补益元气，调理冲任；归来穴活血调经，为治疗经闭之效穴；足三里穴健脾益气，以强后天之本；三阴交穴为肝、肾、脾三经交会穴，可调补肝肾、健脾利湿；丰隆为胃经络穴，联络脾胃二经，有健脾和胃，化痰祛湿之功。有研究表明[15]，针刺足三里、三阴交及丰隆穴，可调节糖脂代谢、减轻IR。朱琏抑制Ⅱ型针法以缓慢捻转针法进针，将针缓慢地从穴位的浅层剌入深层，一能更好激发皮部“卫外而为固”的作用；二能很好地调控运针的深浅层次，以得气为度，避免过多地刺伤组织，保护精气不受损伤，；三能起到守神、治神的作用，临床研究发现PCOS患者多与焦虑共存[16]，朱琏抑制Ⅱ型针法由于进针手法轻缓，极少疼痛，皮肤感觉麻痒舒适[17]，能在不同程度上消除PCOS患者紧张、焦虑的心理。

大量研究证明[18]，针刺在治疗PCOS上取得了一定的疗效，尤其在诱导排卵、调整内分泌及糖脂代谢方面。针刺效应的产生依赖于穴区特殊的感受器，不同类型的神经纤维、中枢系统、组织效应器所构成的网络体系[19]。目前针刺治疗PCOS-IR主要采用电针、普通针刺、穴位埋线等方法，针刺深度往往直达深层组织，忽视了浅层组织神经细胞对机体内部的调节作用。朱琏抑制Ⅱ型针法通过调节神经的自我修复、调整和代偿机能而发挥调整生殖、内分泌系统的功能。该针法采用缓慢捻转的进针手法，在皮肤及皮下各层均能给予针刺刺激。浅部组织(如体表、毛囊等)具有丰富的感受器及多样化的神经末梢。有研究发现，大鼠体表存在环绕周身的信号通路[20]，这便可以使机体各系统之间取得联系。崔晶晶等[21]通过对比大鼠足三里穴区深浅层组织神经纤维、免疫细胞的分布及化学特性差异，推测穴区局部的外周免疫细胞、位于脊神经节和脊髓背角的神经元神经递质的释放，以及受体数量的改变、小胶质细胞的状态和细胞内钙结合蛋白的变化共同介导了穴区深刺、浅刺的起始效应。朱琏抑制Ⅱ型针法更强调“皮部感觉”的刺激，提高穴区浅层神经细胞的兴奋性，避免了兴奋深部组织细胞而抑制浅部组织经络生理功能发挥的问题[16]。而且，每个机体都有适合于自己的刺激强度和频率，该针法能较好地控制运针的深浅层次，并且刺激量适中，能使机体出现局部或放散性的轻度酸、麻感，这种良性的刺激强度和频率以及运针方式可能通过多种神经纤维的复合反应，使神经系统产生较强烈的效应，激发机体对内外环境变化的应变能力，这体现了朱琏抑制Ⅱ型针法神经机能调节的优点。

PCOS的主要代谢紊乱是IR。当胰岛素与靶细胞受体结合后，具有信号转导作用的跨膜蛋白β亚基自身磷酸化，激活酪氨酸激酶，细胞内底物IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化进而启动下游信号转导系统形成级联反应，完成胰岛素信号转导，促进葡萄糖转运摄取及利用[22]。结合近期研究发现，与其他IR不同，PCOS-IR的发生并不是由胰岛素受体数量和结合下降造成的，其发生的主要分子生物学机制是胰岛素受体后信号转导异常[23]，当卵巢组织IRS-1、IRS-2表达失衡时，细胞内胰岛素受体信号转导及生物学效应即受影响[24-25]。刘义等[26]研究发现，与正常组比较，PCOS患者卵巢颗粒细胞中IRS-1表达增高，IRS-2表达降低。本实验研究发现模型组大鼠IRS-1、IRS-2蛋白表达均降低，且免疫组化结果显示IRS-2蛋白染色较IRS-1浅，说明PCOS卵巢组织存在IRS-1和IRS-2蛋白表达的失衡，这种失衡可能参与了PCOS-IR的病理过程，并影响卵巢细胞能量代谢及卵泡生成发育。

本实验结果显示：通过阴道涂片观察到PCOS模型组大鼠动情周期紊乱，血清FINS水平及HOMA-IR值升高，卵巢组织中IRS-2蛋白染色较IRS-1浅，IRS-1、IRS-2蛋白染色较空白组浅，IRS-1、IRS-2蛋白的表达均明显低于空白组，Western blot结果与免疫组化一致，表明模型组大鼠存在IR及卵巢组织IRS-1和IRS-2蛋白表达失衡，这种失衡可能是PCOS-IR形成的机制之一。给予朱琏抑制Ⅱ型针法针刺上述穴位后，PCOS-IR大鼠血清FINS、HOMA-IR降低，卵巢中IRS-1、IRS-2蛋白表达增强，其改善IR效果与炔雌醇环丙孕酮联合二甲双胍相当，提示朱琏抑制Ⅱ型针法可能通过调节和平衡卵巢组织IRS-1、IRS-2的表达，提高胰岛素敏感性，调节胰岛素的分泌，从而改善PCOS的卵巢能量代谢障碍，为临床应用该针法治疗PCOS提供了理论依据。本研究初步阐明了朱琏抑制Ⅱ型针法治疗PCOS伴胰岛素抵抗的作用机制，但未与其他针刺方法进行比较，将朱琏抑制Ⅱ型针法与其他针刺方法作对比，进一步深入挖掘朱琏抑制Ⅱ型针法的作用特点及更深层次的作用机理是今后研究的方向。