混合标准溶液加样法快速测定食品中的阿斯巴甜和阿力甜

高向阳,张芳

(1.郑州科技学院 食品科学与工程学院，郑州 450064；2.郑州市食品安全快速检测重点实验室，郑州 450064)

阿斯巴甜(C14H18N2O5)，白色结晶状粉末，甜度约是蔗糖的200倍，在水中的最大溶解度为1%(25 ℃)。常温下，在pH为3～5的弱酸性溶液中十分稳定，高温或高pH条件下会水解而导致甜味丧失[1-3]。阿力甜(C14H25N3O4S)，白色、无臭的结晶性粉末，甜度为蔗糖的2000倍以上，易溶于水。室温下，阿力甜在弱酸溶液中半衰期为1～1.6年，在pH 5～8水溶液半衰期为5年[4-5]。阿斯巴甜和阿力甜广泛应用于食品行业中，对糖尿病人无影响，但若过量食用，可能会造成人体肝脏被破坏、神经系统紊乱、致癌等[6-10]。

目前，食品中测定阿斯巴甜和阿力甜的方法有高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法、反高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、超高效液相色谱-串联质谱法、离子色谱法(IC)等[11-26]，而且常用内标法、外标法或归一化法进行定量分析。这些测定方法操作繁杂，需测定空白溶液、绘制标准曲线或进行复杂计算，工作效率较低。

混标加样法是一种新型分析技术，克服了上述分析方法的不足，只需取两份同一标准液，一份不加试液，一份加一定体积的试液，混匀后在同一条件下进行测定。以相同保留时间下组分色谱峰信号是否有增加进行定性分析，以色谱峰信号值代入公式进行定量分析，无需绘制标准曲线和测定空白溶液，具有成本低、测定速度快、工作效率高、准确度高、适用范围广等突出优点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

可口可乐、菊花晶、酸奶、浓缩果汁、巧克力制品：市售，购于郑州市二七区马寨镇好又多超市。

甲醇(色谱纯)、乙醇(优级纯)、阿力甜标准品(C14H25N3O4S，CAS号：80863-62-3，含量为99.2%)：上海安谱实验科技股份有限公司；阿斯巴甜标准品(C14H18N2O5，CAS号：22839-47-0，含量为95%)：BePune实验科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

A100250多管涡旋混合仪 月旭科技股份有限公司；MS150/MS205DU电子天平(十万分之一) 长沙市秋龙仪器设备有限公司；英国Dynamica V18R台式冷冻离心机 北京五洲东方科技发展有限公司；SB25-12DTD型超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Utimate 3000 (2017LH131)高效液相色谱仪 赛默飞世尔科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准混合液的制备

乙醇-水(2+1)：取40 mL乙醇，用20 mL的水均匀混合。

80%-甲醇-水：取80 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

50%-甲醇-水：取50 mL甲醇，用水定容到100 mL容量瓶中。

阿斯巴甜和阿力甜标准储备液的配制(0.50 mg/mL)：称取阿斯巴甜0.02632 g(精确至0.0001 g)、阿力甜0.02520 g(精确至0.0001 g)，用水将阿斯巴甜和阿力甜分别溶解至50 mL容量瓶内并定容至刻度，置于4 ℃左右的冰箱中保存，有效期为3个月。

阿斯巴甜和阿力甜混合标准工作液系列的配制：将阿斯巴甜和阿力甜标准储备液用水逐级稀释，等浓度等体积混合。

1.3.2 试液的制备和测定

分别制得20.00，10.00，5.00，2.50，1.00，0.50 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜的混合标准溶液，置于4 ℃左右冰箱中保存，有效期为1个月。

1.3.2.1 碳酸饮料、固体饮料

称取约5.0000 g(精确到0.001 g)碳酸饮料试样于50 mL烧杯中，在超声波振荡器上除去二氧化碳，转入25 mL容量瓶中，用水定容，备用。

称取约1.0000 g(精确到0.001 g)固体饮料试样于50 mL烧杯中，加10 mL水，超声波振荡提取20 min，移入25 mL容量瓶中；再向烧杯中加入10 mL水超声波振荡提取10 min，将两次提取液移入同一个25 mL容量瓶中，用水定容，混匀，备用。

将上述容量瓶的液体分别在4000 r/min离心机上离心5 min，用0.45 μm的水系滤膜过滤上清液后作为待测试液，用于液相色谱分析。

1.3.2.2 酸奶、乳饮料

称取5.0000 g(精确到0.001 g)酸奶于50 mL离心管中，加入10 mL乙醇沉淀酸奶中的蛋白质，盖紧盖子；上下轻轻颠倒离心管5次(不能振摇)，将离心管混匀涡旋10 s后，静置1 min，用4000 r/min离心机离心5 min，取上清液滤入25 mL容量瓶中，滤渣用8 mL 乙醇-水(2+1)洗涤后再离心，上清液移入同一个容量瓶中，用乙醇-水(2+1)定容至25 mL，混匀，用0.45 μm有机系滤膜过滤后得待测试液，用于液相色谱分析。

1.3.3 色谱条件

高效液相色谱仪：Utimate 3000(2017LH131)；色谱柱：Hypersil GOLD C18(150 mm×4.6 mm，SN：10567553)。流动相：甲醇∶水为40∶60；流速：0.8 mL/min；检测器：紫外检测器；检测波长：200.0 nm。

1.3.4 色谱分析方法

取两份完全相同的混合标准液于离心管A和B中，离心管B中加入待测试液混匀。在同一色谱条件下，对离心管A中混合标准液进行色谱分析，得出阿斯巴甜的保留时间ts1及对应的出峰信号hs1、阿力甜的保留时间ts2及对应的出峰信号hs2；对离心管B中混合标准液进行色谱分析，得出阿斯巴甜的保留时间t1及对应的出峰信号hs1+x1、阿力甜的保留时间t2及对应的出峰信号hs2+x2。当ts1=t1，hs1+x1-hs1>0时，则待测食品中含有阿斯巴甜；当ts2=t2，hs2+x2-hs2>0时，则待测食品中含有阿力甜。

1.3.5 测定原理和公式

在一定条件下测定时，混合液的质量与产生的测定信号在一定的范围内成正比，则有：

ms=ks×hs。

(1)

ms+mx=ks+x×hs+x。

(2)

在完全相同的条件下测定时，公式(1)、(2)中的k相同，因此，公式(1)除以公式(2)有：

因此，

(3)

(4)

式中：ms为阿斯巴甜或阿力甜在混合标准液中的质量，hs为对应于ms所产生的测定信号，mx为混合标准液加入待测试液，试液中阿斯巴甜或阿力甜的质量，hs+x为对应于(ms+mx)所产生的测定信号，m样为待测试液中所含称取样品的质量，w为阿斯巴甜或阿力甜在待测样品中的质量分数。

2 结果与分析

2.1 加样法色谱图比较分析

取两个相同的离心管A和B，各加入1 μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液45 μL，A管中不加待测试液，B管中加入100 μL可口可乐待测试液，均定容至1.00 mL，混匀后进行色谱分析。A管得到的液相色谱图见图1，B管的液相色谱图见图2。

图1 阿斯巴甜和阿力甜混合标准液的色谱图Fig.1 Chromatogram of aspartame and alitame mixed standard solution

图2 阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入可口可乐的色谱图Fig.2 Chromatogram of aspartame and alitame mixed standard solution added with Coca-Cola

由图1和图2可知，阿斯巴甜和阿力甜在各自保留时间下，加入可口可乐后，各自的峰高均有增加。保留时间允许的误差范围内ts1=t1，hs1+x1-hs1>0，则可口可乐中含有阿斯巴甜；ts2=t2，hs2+x2-hs2>0，则可口可乐中含有阿力甜，同理，可对其他样品进行定性分析。

根据图1可得，阿斯巴甜的保留时间ts1为3.640 min，峰高hs1为3.852 mAU；阿力甜的保留时间ts2为6.497 min，峰高hs2为2.654 mAU；根据图2可得，阿斯巴甜的保留时间t1为3.640 min，峰高hs1+x1为9.925 mAU；阿力甜的保留时间t2为6.527 min，峰高hs2+x2为6.242 mAU。根据色谱图的峰高，依据公式(3)、(4)可对样品中的组分进行定量分析。

2.2 加样法测定结果及精密度

表1 样品的测定结果Table 1 The determination results of samples

续 表

由表1可知，5种试样测定的RSD均小于5%。由色谱峰高值可简便、快速计算出食品中待测组分的含量，也可用峰面积数据代入相应公式计算。

2.3 样品的检出限和定量限

根据表1，按3倍标准偏差计算检出限，按10倍标准偏差计算定量限。5种待测食品中阿斯巴甜和阿力甜的检出限、定量限见表2。

表2 样品的检出限和定量限Table 2 The detection limits and quantitative limits of samples mg/kg

由GB 5009.263-2016《食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定》的检出限和定量限可知[27]，碳酸饮料、液态乳饮料中阿斯巴甜和阿力甜的检出限为1.0 mg/kg，定量限为3.0 mg/kg；浓缩果汁中阿斯巴甜和阿力甜的检出限为2.5 mg/kg，定量限为7.5 mg/kg；巧克力制品、水果及其制品、固体饮料及其制品中阿斯巴甜和阿力甜的检出限为5.0 mg/kg，定量限为15.0 mg/kg。该方法的检出限和定量限均低于国家食品安全标准中的检出限和定量限。

2.4 加标回收率

以酸奶测定加标回收率，分别对样品进行3个水平的加标回收，每个水平做6次平行测定，检验无可疑值后，取峰高平均值计算，见表3。

表3 样品的加标回收率Table 3 The standard recovery rates of samples

由表3可知，酸奶中阿斯巴甜的回收率为90.3%～97.2%，阿力甜的回收率为91.0%～96.8%。由于各组分在色谱柱中得到了充分分离，互不干扰，该法尤其适用于多组分的色谱定性和定量分析，由各组分依次出现的色谱峰信号值，可快速计算各组分含量和回收率。

2.5 国标法对比实验

2.5.1 国标法标准曲线的回归方程

按国标法规定的波长和色谱条件，以50.00，45.00，40.00，35.00，30.00，25.00，20.00，10.00，5.00，2.50，1.00，0.50 μg/mL的标准混合使用液各进样5 μL测定，以组分质量浓度为横坐标，以峰高为纵坐标绘制标准曲线，得出阿斯巴甜的回归直线方程为Y=4.6921X-1.4649，阿力甜的回归直线方程为Y=2.8836X-1.1944，相关系数r均为0.9999。

2.5.2 国标法测定结果

按国标法操作步骤，各样品均进行6次平行测定，检验无可疑值后取平均值，见表4。

表4 国标法测定结果Table 4 The determination results of national standard method

由表4可知，国标法采用外标法绘制标准曲线并测定样品中待测物质的含量。结果表明：酸奶中阿斯巴甜和阿力甜含量最低，含量最高的为巧克力；阿斯巴甜的相对标准偏差为0.80%～4.8%，阿力甜的相对标准偏差为0.44%～3.8%。

2.6 显著性检验

以酸奶为样品，样品前处理依据GB 5009.263-2016，用该法和国标法进行对照实验，各样品进行6次平行测定，结果见表5。

表5 对照测定结果Table 5 The comparison of determination results

由表5中数据和参考文献[28]可知，计算出的F值小于F检验表中F0.05=5.05，表明混标加样法与国标法之间不存在显著的偶然误差。计算出的t值小于t检验表中t0.05=2.23，表明混标加样法与国标法间也不存在显著的系统误差，结论的置信度为95%。

3 结论

方法所用标准溶液、待测液和试剂量少，成本低，操作简单，无需绘制标准曲线，无需测定空白和复杂计算，可快速获得分析结果，实现了标准溶液和试液在同溶液背景、同体系、同方法、同仪器、同条件、同步操作下进行同时定性、定量分析，准确度得到保障和提升，有一定的创新性。由于各组分在色谱柱中得到了充分的分离，相互之间不干扰，尤其适用于色谱多组分的同时定性和定量分析。与国标法对照，用于测定食品中的阿斯巴甜和阿力甜，经检验无显著性差异。

该法不仅适用于液相色谱法，也适用于气相色谱、离子色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳色谱法，以及化学发光、分子荧光、磷光分析法、生物发光分析法、原子发射光谱、原子吸收光谱、原子荧光光谱和紫外可见分子吸收光谱等诸多分析技术，不仅适用于阿斯巴甜和阿力甜的测定，也适用于其他物质诸多组分的测定。根据所用方法不同，测定信号可以是色谱峰峰面积、色谱峰峰高、吸光度A、相对发光强度I等，方法的可行性和推广应用领域十分广泛。