鸡滑液囊支原体的分离及生物学特性鉴定

郑朝朝 邹立宏 刘思桐 郁宏伟 赵玉龙 张新新/瑞普（保定）生物药业有限公司 河北保定071000

鸡滑液囊支原体（Mycoplasma Synoviae，MS）主要侵害商品肉鸡、蛋鸡或种鸡，引起关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎，是除鸡毒支原体之外另一种引起家禽疾病的重要支原体病原，给国内外养禽业带来了很大的危害。鸡滑液囊支原体病主要通过疫苗免疫和抗菌药物进行控制，目前我国主要依靠抗菌药物控制该病。

本实验旨在筛选敏感的抗菌药物，为该发病蛋鸡场合理用药提供依据，对分离株的生物学特性进行研究，为开发鸡滑液囊支原体疫苗提供材料。

1 材料

1.1 抗菌药物抗菌药物原粉均由瑞普(天津)生物药业有限公司提供。

1.2 标准品标准阳性血清，标准阴性血清，MS 检验用菌株均购自中国兽医药品监察所。

2 方法

2.1 诊断2018 年，保定某中小型蛋鸡养殖场，30%鸡只发生跛行、瘫痪，采食量、产蛋量明显下降，经了解未免疫鸡滑液囊支原体疫苗，疑似发生鸡滑液囊支原体疫情。用IDEXX 鸡滑液囊支原体抗体检测试剂盒对鸡群ELISA 抗体水平进行检测。

2.2 病料采集及分离培养无菌采集附关节内容物和爪垫内容物，置于改良Frey 氏液体培养基内，37℃培养，待培养基颜色变黄后，接种到新的液体培养基中，稳定传代3 次。

将培养液接种到改良Frey 氏固体培养基，37℃培养7d，每天观察。待低倍显微镜下发现典型支原体菌落，挑取单个菌落接种至改良Frey 氏液体培养基培养至颜色变黄。

2.3 分离鉴定

2.3.1 鸡红细胞吸附试验取鸡红细胞悬液加入已培养好的固体培养基表面，室温下作用20min 后弃去，生理盐水洗涤2 次，在低倍显微镜下观察菌落表面有无红细胞吸附。

2.3.2 血清学实验培养的菌液经12000rpm，30min 离心收集管底菌泥进行平板凝集试验。

2.3.3 代谢抑制试验

2.3.3.1 菌液稀释 将培养的菌液用改良Frey 氏液体培养基稀释1000 倍后备用。

2.3.3.2 标准阳性血清稀释 取1ml 标准MS 阳性血清，用Frey 氏液体培养基进行2 倍梯度稀释至第10 管，第10 管弃去1ml 混合液。

2.3.3.3 培养 将稀释后菌液加至稀释后阳性血清中，1ml/管，混合均匀后置于37℃培养，每天观察、记录培养液颜色变化。

2.3.2.4 对照设置 设置菌液滴度测定对照管。

2.3.4 PCR 扩增VlhA 基因根据GenBank 中基因序列，设计合成了一对特异性引物，预期片段大小为773kb。试剂盒法提取模板DNA 进行PCR 扩增。

2.3.5 鸡胚感染实验取培养的菌液经卵黄囊接种5 枚7日龄SPF 鸡胚，0.2ml/胚。另设5 枚SPF 鸡胚作为阴性对照。置37℃孵化器内继续孵化，每日观察并记录鸡胚死亡情况。

2.3.6 人工感染致病性实验取培养的菌液经爪垫接种5只40 日龄SPF 鸡，每只接种0.2ml。另设5 只SPF 鸡注射改良Frey 氏液体培养基做为阴性对照。

2.4 免疫原性实验和本动物攻毒保护实验分离菌培养物灭活后制备成疫苗，备用。

分离菌制苗后接种21 日龄SPF 鸡10 只，颈部皮下注射，0.5ml/只，同时设置空白对照、攻毒对照各10 只。

免疫后4w 测定血清抗体，免疫后30d，连同对照组每鸡右脚垫注射0.2ml×106.0CCU 该分离株活菌，隔离饲养观察14d，判定攻毒保护率。

2.5 抗菌药物最小抑菌浓度测定

2.5.1 抗菌药物稀释配制各管抗菌药物浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.1563μg/ml、0.0781μg/ml、0.0391μg/ml、0.0195μg/ml。

2.5.2 菌液稀释将培养的菌液用改良Frey 氏液体培养基稀释1000 倍备用。

2.5.3 最小抑菌浓度测定将稀释后菌液加至稀释后抗菌药物中，1ml/管，混合均匀后置于37℃培养，每天观察培养液颜色变化，直至第10d。

2.5.4 对照设置设置菌液滴度测定管。

3 结果与分析

3.1 临床诊断ELISA 抗体检测结果显示，抽检的96 份血清样本中有78 份呈现阳性，鸡滑液囊支原体抗体阳性率高于80%。

该鸡场病鸡状态和病变符合鸡滑液囊支原体发病特点，未进行免疫情况下ELISA 抗体阳性率高于80%，初步确定该场发生鸡滑液囊支原体疫情。

3.2 病料采集及分离鉴定分离菌经瑞氏染色在油镜下呈圆形或椭圆形，固体培养基上菌落表现为细小、光滑、半凹陷于培养基内，低倍镜下观察到菌落形态为特征性的“煎蛋状”。

3.2.1 鸡红细胞吸附试验分离菌菌落与红细胞作用、盐水洗涤后，在低倍显微镜下可见菌落表面有红细胞吸附。

3.2.2 血清学实验平板凝集试验结果显示，该分离菌能与MS 标准阳性血清发生凝集反应，而与MG 标准阳性血清不发生凝集反应。血清学试验结果表明该分离菌为鸡滑液囊支原体。

3.2.3 代谢抑制试验培养至第5d，代谢抑制试验对照管的培养液变为黄色，菌液滴度对照管第6 管变为黄色，血清对照管培养液颜色无变化，加有抗血清的第7 管变为黄色，其余3 管未变色。

培养至第7d，菌液滴度对照管第9 管变为黄色，血清对照管培养液颜色无变化，加有抗血清的第7 管为黄色，其余3 管未变色。

该分离菌的代谢抑制效价为128。

3.2.4 PCR 扩增Vlh A 基因PCR 扩增结果显示分离株和检验用株均能扩增出特异性的目的片段，大小约773bp，而MG-CR 株未能扩增出任何条带。（图4）

图4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图

测序结果显示，分离菌株与NCBI 登陆的基因同源性为90%。

3.2.5 鸡胚感染实验接种该分离菌的SPF 鸡胚于120～144h 全部死亡，对照组正常。卵黄液PCR 可扩增出特异性片段。

3.2.6 人工感染实验接种该分离株的5 只SPF 鸡均出现特征性病变：爪垫肿胀突出，剪开后有淡黄色黏性渗出物，PCR 能扩增出鸡滑液囊支原体预期大小的片段。对照组SPF鸡后食欲正常，关节处均未见肿胀。

3.3 免疫原性实验和本动物攻毒保护实验抗体检测结果显示：免疫后2 周血清MS 抗体阳性率30%，免疫后3 周血清MS 抗体阳性率50%，免疫后4 周血清抗体阳性率为100%。

攻毒保护结果显示：攻毒对照组攻毒后6d 开始个别鸡只跗骨、胸骨肿胀，免疫组无明显眼观变化。攻毒后14d，攻毒对照组7/10 发病，免疫组3/10 发病。（表1）

表1 分离株制苗后免疫原性

3.4 抗菌药物最小抑菌浓度测定最小抑菌浓度（MIC）实验结果显示：稀释前菌液滴度为109.0CCU，阳性对照管于培养第4d 全部变色，而阴性对照管培养至第10d 未变色；抗菌药物的实验管不同程度变色。

表2 各抗生素对分离株最小抑菌浓度

上述结果显示该分离菌对沃尼妙林敏感性最高，MIC 约为0.0195μg/ml；对林可大观、泰万菌素、泰妙菌素、泰乐菌素较为敏感；而对氟苯尼考、替米考星和恩诺沙星有耐受。

4 讨论

本研究对病鸡跗关节、爪垫渗出液样品进病原分离鉴定，分离菌在固体培养基上菌落形态为特征性＂煎蛋状”，结合进一步的红细胞吸附试验、血清学实验、代谢抑制试验、PCR扩增及人工感染试验确诊为鸡滑液囊支原体。

本研究中分离的MS 菌株对SPF 鸡有较强的致病性，动物回归实验可致SPF 鸡出现典型的临床症状，将此分离株制备成灭活疫苗对攻毒有7/10 保护，可做为MS 疫苗株候选株。

本研究对分离菌株选用了8 种抗菌药物进行药物敏感试验，对临床防治鸡滑液囊支原体有重要的指导意义。□