锦鲤昏睡病(KSD)的实验室诊断分析(下)

刘 群，王 菁，刘桐山，王 钢，韩进刚，冯守明

(1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；2.天津市水产研究所，天津 300221)

4.寄生虫检测和细菌分离结果

经制片和显微观察，所检锦鲤病鱼组织均未观察到寄生虫。将病鱼脑、肝胰脏、脾、肾组织病料接种于LB平板上，28℃培养24小时，未见细菌生长。

5.分子生物学检测结果

采用相关检测方法对2018年7月末采集的患病锦鲤鳃组织样品进行SVCV、KHV、CyHV-II、CEV分子生物学检测，结果显示，发病锦鲤鳃组织样品均未扩增出SVCV、KHV、CyHV-II特异性片段(未列出)；CEV TaqMan荧光定量检测方法结果如图4A，显示该样品Ct值小于35，CEV为阳性。

6.人工感染试验结果

养殖水温为(25±2)℃时，由患病锦鲤鳃组织制备组织悬液腹腔注射感染健康锦鲤，并依据《鲤浮肿病诊断规程》(SC/T 7229－2019)中的检测方法对注射组、对照组锦鲤鳃组织进行CEV TaqMan荧光定量PCR检测，结果如图4B所示。人工感染试验结果显示，注射组死亡锦鲤未呈现CEV典型症状，统计锦鲤累积死亡率，其累积死亡率为(65±7.07)%，半数致死时间(LT50)为16天；对照组累积死亡率为(15±7.07)%(图5)。CEV Taq-Man荧光定量PCR检测结果显示，注射组20尾锦鲤中有14尾为CEV阳性，其阳性检出率为70%，对照组未检出CEV。

图4 锦鲤鳃组织样品CEV TaqMan荧光定量PCR扩增曲线

图5 人工感染试验中累积死亡率与注射时间关系

三、讨论

本研究根据天津市北辰区某锦鲤养殖场患病锦鲤流行病学调查及病理学、寄生虫学、细菌学、病毒学鉴定结果，确定2018年夏季引起该养殖场锦鲤暴发性死亡的原因为锦鲤睡眠病(KSD)，其病原为鲤浮肿病毒(CEV)。

从临床症状上看，病鱼常聚集于水面或池塘边缘，或静置于池中倒向一侧，呈昏睡状态。受触动时会游动，但很快处于昏睡状态。大多表现出烂鳃、体表糜烂、出血、皮下组织水肿、眼球凹陷、食欲不振、吻端和鳍基部溃疡等临床特征(Adamek M等，2017；吕晓楠等，2018)。本研究中感染KSD锦鲤表现出与之相似的临床表观特征，不同的是笔者所解剖锦鲤未观察到体表糜烂、出血、皮下组织水肿、吻端和鳍基部溃疡病变特征。针对人工感染试验后出现的临床症状也有不同报道，Oyamatsu T等(1997b)、Miyazaki T等(2005)和刘群等(2018)通过人工感染方式回接健康鲤，导致实验鱼部分出现与自然发病鱼相似症状而死亡；Adamek M等(2016)、Matras M等(2016)和王小亮等(2017)研究发现部分实验鱼感染CEV，但未呈现典型症状和大量死亡现象。本研究人工感染试验可致70%锦鲤感染CEV，且(65±7.07)%出现死亡，但未表现出典型临床症状。由此推测，鲤感染CEV出现KSD典型临床症状和大量死亡可能由其他因素引起，仍需深入研究。

从组织病理结果上看，包括烂鳃在内的鳃丝损伤是受感染锦鲤最常见的症状。低倍镜观察到鳃组织上皮细胞过度增殖导致鳃丝肿胀；高倍镜下显示鳃细胞水肿、重度增生，鳃小片有融合及上皮细胞脱落(Lewisch E等，2015；Adamek M，2017；Ono S I，1986)。本研究显示患病锦鲤鳃组织为主要病变组织，其病理特征与Lewisch E等(2015)、Ono S I(1986)、Oyamatsu T等(1997b)的研究结果相似。此外，患KSD的锦鲤肝胰脏、肾脏和脾脏也都发生不同程度病变，出现细胞广泛水肿，可见疑似包涵体、炎症细胞浸润等较严重病理变化，而其脑组织整体结构正常，未见明显病理变化。Oyamatsu T等(1997b)认为CEV感染鲤引起的鳃损伤导致患病鱼鳃组织和内脏组织呈现病理变化。由此推测，引起KSD的致病原侵染鱼体后在最易受寄生虫或水质影响而被破坏的鳃组织内增殖，使鳃丝末端细胞增生，并随血液进入体内组织，从可能影响血液气体交换发展到体内组织发生变质性炎症，导致鱼出现缺氧、浮头、反应迟缓，致使鱼体呼吸及渗透压调节发生障碍，肝胰脏、肾、脾等重要器官正常的生理代谢功能受到损害，终至死亡。

国外现有研究表明痘病毒科种类传播主要方式是经皮肤伤口感染，并在鳃组织中观察到病毒粒子，认为鳃是CEV在鱼体内引起典型病变的主要部 位(Jung S V，2015；Rajaswaminathan T，2016；Ono S I，1986)。国内现有研究已在肾组织中观察到形态类似痘病毒颗粒(徐立蒲等，2017)，表明其可在肾组织中增殖富集。本次实验室诊断在发病鱼脾组织中观测到大量病毒样颗粒，表明除鳃、肾组织外，CEV也可在脾组织增殖，提示做病原检测等研究时，可取鳃、肾、脾组织；而电镜观测病毒方法虽直观有效，但其制备过程较复杂，周期较长，多用于科研，不适用于临床检测工作。

通常认为水温是发生CED、KSD的环境诱因。Miyazaki T等(2005)认为水温是影响CEV的重要环境因子。研究发现，较低水温(6～10℃)时，锦鲤感染CEV病程较长，死亡率较低；15～25℃时，幼鱼累积死亡率高达75%～100%；较高温度时，实验鱼最初仅昏睡，2～3天大量死亡。有调查研究发现，该病在我国河南等地有两个发病高峰时间，即5－6月和9月(吕晓楠等，2018)。这两个时间段的水温一般维持在20～27℃。本研究进行的人工感染试验可导致锦鲤累积死亡率达到(65±7.07)%，表明在(25±2)℃下CEV可致锦鲤出现大量死亡。据此推测CEV在我国传播最适水温可能是20～27℃。同时，综合现有资料，CEV可在较宽温度范围内(6～27℃)被检出，提示该病暴发可能是包括温度在内的其他因素共同作用的结果。

针对KSD防控方面，Miyazaki T等(2005)、Seno R等(2003)研究指出，将发病鱼从饲养池取出，当水温升到20～25℃时，使用6‰～7‰盐水加抗生素持续进行药浴10～14天，对防控此病有显著效果。另外，进入越冬池时，可以使用6‰～7‰盐水浴并升温，之后逐渐添加少量新水以冲淡盐水，可预防此病。但是体形较小幼鱼较难恢复，通常多在采卵时采取净化措施预防。使用此种方式能够抑制病原体黏附宿主，提高鱼体免疫力，帮助维持鱼体渗透压，有助于降低该疫病发生时鱼体死亡率，但是治愈后的鱼仍可能具有传染性，并不能从根本上杀死或消灭病毒。

本研究综合应用流行病学调查、病理学、寄生虫学、细菌学方法，并依据针对病毒P4a基因设计的荧光定量PCR检测方法将导致此次锦鲤暴发性死亡的致病原鉴定为CEV。值得注意的是，该养殖场此前未曾暴发过KSD。推测该养殖场可能存在其他途径的病原传入风险，仍有待进一步调查以证实。因此，在生产中要严格执行消毒和隔离制度，通过检测、检疫防止病原侵入，采取生物安保措施防范KSD的发生和蔓延。

(全文完)