响应面优化超临界CO2 萃取大果紫檀挥发油的工艺研究*

李宝志 李 锋 朴永革 陈 明 佟亚楠

（吉林烟草工业有限责任公司技术研发中心，吉林 长春 130031）

大果紫檀（Pterocarpus macrocarpusKurz）为蝶形花科紫檀属植物，别名缅甸花梨、草花梨，是最常见的花梨木类木材之一，原产于缅甸、泰国、老挝、柬埔寨和越南[1-3]。其心材是制作实木家具、高端乐器、美工饰品等的优选材料[4-5]。树皮和根可以入药，味辛、性温、无毒[6-7]，入脾、胃、肺经。大果紫檀心材本身香气浓郁，具有凝神和抗疲劳等作用，其含挥发油3%～5%，主要为萜烯、萜醇和类黄酮等多种活性成分，是贵重的药材和名贵的香料[8-10]。大果紫檀心材在加工过程中，会产生大量的边角料和刨花，未被有效利用，造成资源的浪费。利用这些加工产生的边角料和刨花提取大果紫檀挥发油，作为特色天然植物香原料使用，可提高其经济实用价值[11-12]。

香料在刺激人类味觉和嗅觉神经方面起到关键性的作用，已被广泛应用于食品、日化、烟草、医药等行业[13-14]。天然香料因其制备工艺不同而性状不同，分为精油、净油、浸膏、酊剂、油树脂等[15-16]。目前，传统的香料提取方法虽然多样，但在提取时会对草本植物中有效成分和香气品质造成破坏，降低其有效成分的收率，同时增加生产成本[17-19]。因此，本文采用超临界CO2萃取的方法提取大果紫檀挥发油成分，通过单因素试验探究萃取温度、萃取压力、萃取时间等因素对提取效果的影响，采用响应面分析法优化了挥发油工艺条件，并以气相色谱-质谱法（GC-MS）对大果紫檀挥发油化学成分进行分离和鉴定，研究成果对于充分挖掘利用天然香源植物资源优势，研制开发新型特色天然植物香料具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

大果紫檀（心材）切片，由云南农业大学（云南省高原特色农业产业研究院）提供；CO2（食品级），纯度≥99.9%，长春市氧气厂；二氯甲烷为色谱纯，德国Merck公司；水杨酸乙酯，纯度≥98%，美国Sigma-Aldrich公司；无水硫酸钠为分析纯，北京化工厂。

1.2 设备

超临界CO2萃取仪（HA220-50-06 型），南通市华安超临界萃取有限公司； LG-1 食品型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技公司；多功能粉碎机，上海兆申科技有限公司；气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890B/5977C），美国安捷伦公司；ML204T型电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；超纯水机（Milli-Qintegral 10），美国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

大果紫檀心材经切片后，用食品型真空冷冻干燥机进行低温干燥，干燥12 h后，用多功能植物粉碎机粉碎，过80 目筛网，即制得大果紫檀试样。

1.3.2 超临界萃取单因素试验设计

采用单因素试验，对影响大果紫檀挥发油得率的工艺条件进行优化和分析。称取200 g大果紫檀粉末置于超临界CO2萃取釜（1 L）中，在一定萃取温度、萃取压力和萃取时间下进行提取，计算挥发油得率。

1.3.3 大果紫檀挥发油得率计算

式中：Y为挥发油得率，%；Mq为挥发油质量，g；My为大果紫檀粉末质量，g。

1.3.4 响应面法优化超临界萃取工艺条件

根据大果紫檀挥发油单因素试验结果，确定萃取温度（A）、萃取压力（B）和萃取时间（C）为影响挥发油得率的3 个主要因素，运用Box-Behnken响应面法优化试验（Design-Expert8.0.6 软件），以大果紫檀挥发油得率（Y）为响应面值，取最优异的水平组合进行三因素三水平响应面试验，试验因素与水平见表 1。

表1 响应面试验因素与水平Tab.1 Factors and levels used in response surface design

1.3.5 大果紫檀挥发油的GC-MS分析[20]

称取0.01 g大果紫檀挥发油于50 mL具塞三角瓶中，依次加入二氯甲烷萃取剂10 mL和50 μL水杨酸乙酯内标溶液（浓度为10 mg/mL），混合均匀后进行无水硫酸钠脱水处理，静置至样品分层，取下层溶液用0.45 μm微孔过滤膜过滤，备用。

采用气质联用对萃取得到的大果紫檀挥发油进行化学分析。GC-MS分析条件：Agilent HP-5MS毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；进样体积：1 μL；分流比：不分流；流速：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；程序升温：起始温度50 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速率，升至240 ℃保持2 min，再以10 ℃/min的速率，升到270 ℃保持8 min；电离方式：电子轰击；电离能量：70 eV；传输线温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；扫描范围：40～400 m/z；使用Nist和Wiley谱库检索。

2 结果与分析

2.1 大果紫檀挥发油提取单因素试验[21-22]

2.1.1 萃取温度对挥发油得率的影响

称取200 g大果紫檀粉末置于超临界CO2萃取釜中，萃取压力25 MPa，萃取时间90 min，研究在35、40、45、50、55、60 ℃不同温度下挥发油提取率的变化，结果如图1 所示。由图可知，在相同萃取压力和萃取时间条件下，大果紫檀挥发油得率随着萃取温度的升高先增加后减少。35～45 ℃时，提取率随着温度的升高而快速增加；45～50 ℃时，提取率的增加速度趋于平缓；50 ℃后，提取率随着温度的升高呈现下降趋势，并且得到的挥发油色泽变深、性状较差，可能是温度升高，导致了某些香气物质和活性成分分解，同时心材中的色素、纤维和果胶等物质也被提取出来，使得挥发油得率略有下降。因此，萃取温度选择50 ℃为宜。

图1 萃取温度对挥发油提取率的影响Fig. 1 Effect of temperature on the extraction rate

2.1.2 萃取压力对挥发油得率的影响

保持其他萃取条件一定，分别在15、20、25、30、35、40 MPa萃取压力下进行挥发油的提取，结果如图2所示。从图中可见，挥发油得率随着压力的升高呈先增加后下降的趋势。在15～25 MPa时，提取率随着温度的升高而急剧上升；在25～30 MPa时，挥发油得率增加趋于缓和；压力超过30 MPa后，挥发油得率随着压力的升高反而下降。因此，萃取压力选择25 MPa为宜。

图2 萃取压力对挥发油提取率的影响Fig. 2 Effect of pressure on the extraction rate

2.1.3 萃取时间对挥发油得率的影响

保持其他萃取条件一定，在萃取时间分别为30、60、90、120、150、180 min条件下进行挥发油提取试验，结果如图3 所示。由图可见，当萃取时间为90 min时，挥发油提取率最高；90 min以后，提取率随时间变化稍有下降。因此，综合考虑，确定萃取时间选为90 min。

图3 萃取时间对挥发油提取率的影响Fig. 3 Effect of time on the extraction rate

2.2 大果紫檀挥发油提取响应面试验

2.2.1 响应面试验结果及分析[23-24]

响应面试验结果如表2 所示。采用Box-Behnken设计方案对表2 中的优化试验结果进行回归分析，对各因素进行回归拟合，得到大果紫檀挥发油得率对萃取温度(A)、萃取压力(B)和萃取时间(C)的二次多项回归方程：Y=3.84-0.100A+0.25B+0.028C-0.018AB-0.002 5AC+0.027BC-0.25A2-0.46B2-0.19C2。响应值的影响程度可由回归方程中各项系数的大小来判断，各因素对响应值的影响程度与二次回归方程中各项系数的绝对值大小成正比关系，系数的正、负反映了影响方向。从回归方程一次项系数可知，影响大果紫檀挥发油萃取因素的主次顺序为：萃取压力(B)＞萃取温度(A)＞萃取时间(C)。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Tab.2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 回归方程及方差分析

回归方程的方差分析和显著性检验结果见表 3。

从表3 可知，回归项中P值＜0.01，说明所选择模型差异极显著。失拟项P值为0.348 9，此失拟项差异不显著(P＞0.05)。由此可知，该模型较显著地拟合了萃取温度、萃取压力和萃取时间对挥发油得率的影响，该模型所得的二次回归方程可代替试验真实点对试验结果进行分析。由此模型的决定系数R2Adj =0.959 6可知其具有较好的拟合程度，95.96 %的响应值变化可通过该模型解释，因此该模型极显著且准确，能够很好地显示大果紫檀挥发油的变化，较好地对挥发油得率进行预测。由表3 可知该二次回归方程系数的显著性，萃取温度(A)、萃取压力(B)、萃取温度的二次项A2、萃取压力的二次项B2、萃取时间的二次项C2对挥发油得率具有极显著的影响；萃取时间(C)、萃取温度与萃取压力的交互项AB、萃取温度与萃取时间的交互项AC、萃取压力与萃取时间的交互项BC对挥发油得率影响不显著。

表3 回归模型方差分析表Tab.3 The analysis table of variance of regression model

2.2.3 响应面与等高线分析[25-27]

按照回归模型绘制响应面和等高线图，图4～6 反映了萃取温度、萃取压力、萃取时间的相互效应之间的关系。

图4 萃取温度与萃取压力交互作用对挥发油得率的影响Fig. 4 Interaction between extraction temperature and extraction pressure effects on the extraction rate of volatile oil

图4 显示了萃取时间位于中心水平时，萃取温度(A)和萃取压力(B)的交互作用对挥发油得率的影响。由图4 可知，萃取温度和萃取压力对挥发油得率变化的影响较强，萃取温度变化对挥发油得率的影响较大，表现为响应曲面图形的坡度较陡和等高线较密；萃取压力变化对挥发油得率的影响相对较弱，表现为响应曲面图形坡度较缓和等高线较稀疏。

图5 显示了萃取压力位于中心水平时，萃取温度(A)和萃取时间(C)的交互作用对挥发油得率的影响。由图5 可知，萃取温度和萃取时间对挥发油得率变化的影响较弱，响应曲面坡度缓和；等高线趋于圆形，表明萃取温度与萃取时间交互作用不显著。

图5 萃取温度与萃取时间交互作用对挥发油得率的影响Fig. 5 Interaction between extraction temperature and extraction time effects on the extraction rate of volatile oil

图6 显示了萃取温度位于中心水平时，萃取压力(B)和萃取时间(C)的交互作用对挥发油得率的影响。由图6 可知，萃取压力和萃取时间对挥发油得率变化的影响相对较弱，萃取压力对挥发油得率影响相对较小，表现为响应曲面坡度较缓，等高线较稀疏；萃取时间对挥发油得率变化的影响较大，响应曲面图形的坡度较陡，等高线较密。

图6 萃取压力与萃取时间交互作用对挥发油得率的影响Fig. 6 Interaction between extraction pressure and extraction time effects on the extraction rate of volatile oil

2.2.4 验证试验分析

通过中心组合设计优化提取条件，得到提取大果紫檀挥发油理想的工艺参数为萃取温度48.94 ℃、萃取压力26.40 MPa、萃取时间92.82 min，此时挥发油得率3.88%。考虑到试验的可操作性和可行性，以萃取温度50 ℃，萃取压力25 MPa，萃取时间90 min进行3 次重复萃取试验，测得得率为3.92%，与模型预测值较接近。因此，响应面法优化得到超临界CO2萃取大果紫檀挥发油的工艺参数准确、可靠。

2.3 大果紫檀挥发油成分分析

采用GC-MS对萃取的大果紫檀挥发油成分进行分析，结果如表4 所示。由总离子流图可知，大果紫檀挥发油中含有的化合物种类较多，通过利用Nist和Wiley谱库检索和人工质谱分析2 种分析方法，综合分析后共鉴定出22 种化学成分，主要成分为沉香螺醇、β-桉叶醇、7-(2-羟丙基)-1,4a-二甲基十氢萘-1-醇、桉油烯醇、3-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)烯丙醇、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基环丙基)-环己烯、高紫檀素、美迪紫檀素、紫檀素、3,9-二甲氧基-6H苯并呋喃[3,2-c][1]苯并吡喃等。

表4 大果紫檀挥发油成分的分析结果Tab.4 Analytical results of volatile oil from Pterocarpus macrocarpus Kurz

3 结论

本文采用超临界CO2萃取大果紫檀挥发油成分，并通过单因素考察和响应面试验确定适宜的提取工艺为萃取温度50 ℃、萃取压力25 MPa、萃取时间90 min，此时挥发油提取率为3.92%。所得回归模型拟合程度较高。通过GC-MS鉴定得出，大果紫檀挥发油包含22 种化学成分，主要成分有沉香螺醇、β-桉叶醇、7-(2-羟丙基)-1,4a-二甲基十氢萘-1-醇、桉油烯醇、3-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)烯丙醇、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基环丙基)-环己烯、高紫檀素、美迪紫檀素、紫檀素、3,9-二甲氧基-6H苯并呋喃[3,2-c][1]苯并吡喃等。使用超临界CO2萃取得到的大果紫檀挥发油味道独特优雅，木香、树脂香和清香突出，且留香时间持久、绵延性好，在日化、食品、医药等行业中具有良好的应用价值。