复方滋补力膏的质量标准提高研究

张 宁，王 翠，王 娟，温望文，谢 亮，明良山，李林福，刘 海，黄 浩

（1. 江西心正药业有限责任公司，江西 萍乡 337053；2. 赣南医学院药学院国家中药现代化工程技术研究中心—客家中医药资源研究分中心，江西 赣州 341000；3. 江西省华药医药有限公司，江西 新余 338000；4. 江西中医药大学高等研究院中医基础理论分化发展研究中心，江西 南昌 330004）

复方滋补力膏由党参、何首乌、枸杞子、熟地黄、黄精五味药材制成，具有益气、滋阴、补肾的功效，主治气血不足、肾虚、体力衰弱、腰酸肢软、耳鸣眼花等症状［1］。复方滋补力膏处方含有丰富的化学成分。而收载于中药成方制剂第14 册（WS3-B-2754-97）的复方滋补力膏现行标准，仅有性状、pH值、微生物限度等常规检查项目［1-2］，不能满足复方滋补力膏质量控制的要求。为了有效控制复方滋补力膏的内在质量，参考相关文献［3-5］采用薄层色谱法（Thin-Layer Chromatography，TLC）及高效液相色谱 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）对复方滋补力膏的质量标准进行研究，以期为该制剂质量标准的提高提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器ZF-1型三用紫外分析仪，高效液相色谱仪（安捷伦1260），色谱柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）。

1.2 试药复方滋补力膏（批号：20151101、20151102、20151103）；缺何首乌阴性样品（江西心正药业有限责任公司提供，取党参、枸杞子、熟地黄、黄精按照复方滋补力膏的生产工艺制得）；缺枸杞子阴性样品（江西心正药业有限责任公司提供，取党参、何首乌、熟地黄、黄精按照复方滋补力膏的生产工艺制得）；二苯乙烯苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110844-201512）；枸杞子对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121072-201410）；乙腈，分析纯，超纯水；硅胶G板（青岛海洋化工厂，0.20～0.25 mm）。

2 方法与结果

2.1 TLC定性鉴定

2.1.1 何首乌薄层鉴别取复方滋补力膏样品10 mL，加水10 mL，摇匀，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，弃去乙醚液，水液用水饱和的正丁醇振摇提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺何首乌的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法同法制成缺何首乌阴性样品溶液。取二苯乙烯苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法（中国药典2015 版第四部通则0502）［6］进行试验。吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-水（7∶65∶55∶12）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在日光下检视。结果：供试品色谱与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；缺何首乌阴性无干扰。经多次试验，本方法简单、灵敏、重复性好，说明此方法专属性较好。见图1。

图1 复方滋补力膏中何首乌的TLC图谱

2.1.2 枸杞子薄层鉴别取复方滋补力膏样品30 mL，加水20 mL，搅匀，用乙酸乙酯50 mL 振摇提取，取乙酸乙酯层，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取缺枸杞子的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液。取枸杞子对照药材0.5 g，加水35 mL，加热煮沸30 min，冷却，过滤，滤液用乙酸乙酯20 mL 振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。参照薄层色谱法（中国药典2015版第四部通则0502）［6］进行试验。吸取供试品溶液10 μL、对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3∶2∶1）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果：样品色谱与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点；缺枸杞子阴性无干扰。经多次试验，本方法简单、灵敏、重复性好，说明此方法专属性较好。见图2。

图2 复方滋补力膏中枸杞子的TLC图谱

2.2 HPLC法含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备取复方滋补力膏样品约5 g，精密称定，置25 mL 棕色量瓶中，加60%乙醇15 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）10 min，冷却，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备取缺何首乌阴性样品适量，按供试品溶液的制备方法：取本品约5 g，精密称定，置25 mL棕色量瓶中，加60%乙醇15 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）10 min，冷却，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，制得缺何首乌阴性样品溶液。

2.2.4 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）填充剂色谱柱；乙腈-水（25∶75）为流动相；检测波长280 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃。按《中国药典》规定，理论塔板数按二苯乙烯苷计算应不低于2 000。

2.2.5 系统适用性试验分别精密吸取二苯乙烯苷对照品、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明：二苯乙烯苷保留时间约在6 min 左右，与其它各峰达到基线分离；缺何首乌阴性无干扰；理论塔板数按二苯乙烯苷峰计为2 000 以上，符合标准规定。本品系统适应性良好。见图3～图5。

图3 二苯乙烯苷对照品溶液HPLC色谱图

图4 供试品溶液HPLC色谱图

图5 缺何首乌阴性溶液HPLC色谱图

2.2.6 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液（二苯乙烯苷浓度为21.84 μg·mL-1）2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，二苯乙烯苷进样量为横坐标，绘制标准曲线。结果：二苯乙烯苷回归方程为：y=3 642.9x+17.428，R2=0.999 6，二 苯 乙 烯 苷 在0.044 7～0.446 8 μg 范围内具有良好的线性关系。见表1和图6。

图6 二苯乙烯苷线性关系图

表1 线性关系考察结果

2.2.7 重复性试验取批号20151101 的复方滋补力膏样品6 份，按照“2.2.4”项下色谱条件测定，计算二苯乙烯苷的含量。结果表明，本法重复性良好。见表2。

表2 重复性试验测定结果

2.2.8 稳定性试验取对照品溶液、供试品溶液，按2.2.4 项的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、18、24小时后依法测定，记录峰面积。结果表明，混合对照品溶液和供试品溶液在24 h 内稳定性良好。见表3。

表3 溶液稳定性试验结果

2.2.9 精密度试验取对照品溶液，连续进样6次，按2.2.4 项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。结果：测定值RSD 为0.35%，仪器精密度良好。见表4。

表4 精密度试验结果

2.2.10 加样回收率试验取已知含量的复方滋补力膏（批号：20150301，每1 g 含101.13 μg 二苯乙烯苷）6 份，各2.5 g，分别精密加入282.10 μg·mL-1二苯乙烯苷对照品溶液1 mL，按供试品溶液的制备方法制备加样回收样品溶液，依法测定，计算回收率，得二苯乙烯苷的加样回收率均在95%～105%之间，平均回收率为99.50%，RSD为0.72%，表明该方法回收率良好。见表5。

表5 加样回收试验结果

2.2.11 仪器及色谱柱耐用性试验取批号20151101 复方滋补力膏样品进行耐用性试验，按照2.2.2 项下方法制备供试品溶液，分别在不同柱温，不同流速，不同流动相比例条件下测定二苯乙烯苷含量。结果：在各试验条件下，待测成分分离较好，测定结果基本一致，耐用性良好。见表6。

2.2.12 样品测定取复方滋补力膏样品3 批（批号依次为20151101，20151102，20151103），按2.2.4项色谱条件进行测定，记录峰面积，外标法计算二苯乙烯苷。结果：3 批样品中的二苯乙烯苷的含量依次为101.33、99.79、100.12 μg·mL-1。

3 讨 论

3.1 薄层色谱鉴定复方滋补力膏处方中包括党参、何首乌、枸杞子、熟地黄、黄精五味中药，药材化学成分复杂，有党参炔苷［7］、二苯乙烯苷［8］、生物碱［9］、多糖［10］等。党参是复方中含量最高的一味药，中国药典将党参炔苷作为党参标识成分进行TLC鉴定［11］，但有研究发现，该方法专属性较差［12］，不适合作为质量控制的标识物质。此外，本组前期研究发现，将熟地黄与黄精进行薄层色谱鉴定时，实验组与阴性对照组结果都不具有显著性差异，因此，二者均不作为薄层色谱鉴定项。通过摸索多种前处理及薄层色谱的条件，再结合复方滋补力膏的功能主治和各药材的药理作用，从中选取何首乌、枸杞子做为鉴别项。试验结果表明，所选取的药味和化学成分在薄层色谱中展开、显色效果显著，重复性好，稳定性可靠。用薄层色谱法鉴定复方滋补力膏中何首乌、枸杞子的方法能够有效对该药进行质量控制。

此外，为评价薄层色谱法的适用性，还对薄层色谱法进行耐用性实验，分别从温度（10 ℃和35 ℃）、相对湿度（42%和88%）以及不同硅胶板（预制板和自制板）等3个方面进行考察。结果发现，复方滋补力膏的TLC 鉴别结果不受温度、相对湿度和不同硅胶板等条件改变的影响。说明薄层色谱法作为复方滋补力膏的定性鉴定方法具有很强的适用性。

3.2 HPLC含量测定现代药理学研究表明，二苯乙烯苷是何首乌主要的活性成分和质量控制的关键成分［13-14］，具有抗衰老、降血脂、保肝、保护肾脏、调节内分泌、增强造血功能等药理作用，与复方滋补力膏的功能主治针对气血不足、肾虚、体力衰弱、腰酸肢软具有极强的相关性。故选用二苯乙烯苷作为复方滋补力膏指标化学成分，进行含量测定。确定采用高效液相色谱法进行检测，通过方法学各项指标考察，均符合中药指导原则的要求，说明该方法可操作性强，专属性好，准确度高，精密度高，稳定性可靠，可以作为复方滋补力膏中二苯乙烯苷定量测定方法。

4 结 论

采用薄层色谱法和高效液相色谱法，研究分析了薄层色谱法鉴定复方滋补力膏中何首乌、枸杞子、二苯乙烯苷的专属性、重复性和稳定性，建立了高效液相色谱法检测复方滋补力膏中有效成分含量的方法，为复方滋补力膏提供新的质量标准。