基于豚鼠呼吸区鼻黏膜形态及肌醇需求酶1α蛋白表达研究醒鼻凝胶滴鼻剂干预变应性鼻炎的机制

刘 文，戴秋芳，吴 雁

(福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004)

变应性鼻炎又称过敏性鼻炎，指暴露在吸入性变应原下，由免疫球蛋白E (IgE)介导的鼻黏膜炎症反应，症状包括喷嚏、鼻黏膜充血、流涕(鼻前或后滴流)及鼻痒[1]。目前全球有9%～42%的成人及儿童患有变应性鼻炎，13～14岁的儿童中变应性鼻炎的患病率为1.4%～39.7%，并且患病率有逐年增长的趋势[2]。肌醇需求酶1α(IRElα)是与内质网应激未折叠蛋白反应(URP)分支中进化最保守的一个内质网应激感应器[3]，在支气管哮喘、癌症等多种疾病中处于激活状态，但该蛋白与变应性鼻炎的相关性研究较少。本课题组前期研究发现醒鼻凝胶滴鼻剂能下调变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜及血清中IRElα mRNA的表达[4]，本研究进一步观察了醒鼻凝胶滴鼻剂对变应性鼻炎豚鼠呼吸区鼻黏膜形态及IRE1α表达的影响，探讨其治疗变应性鼻炎的可能机制。

1 实验材料与方法

1.1药物 中药醒鼻凝胶滴鼻剂(福建省人民医院提供，批号：170703)；布地奈德鼻喷雾剂(雷诺考特，阿斯利康制药有限公司，批号：1703005，规格：1.28 mg/mL)。

1.2主要试剂 卵清白蛋白、氢氧化铝(Sigma公司)；兔抗鼠IRE1α多克隆抗体(Santa Ctuz 公司)。

1.3动物 60只鼠龄为2～3 个月的健康普通级Hartley品系豚鼠，体重350～400 g，雌雄各半，购于重庆市璧山区腾鑫养殖场，合格证号:SCXK(渝) 2017-0010，实验过程中根据中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》处置实验动物。

1.4分组、造模及干预方法 豚鼠经适应性喂养1周，采用简单数字随机及性别、体重的分层随机法分为空白组、模型组、醒鼻凝胶滴鼻剂低剂量组、醒鼻凝胶滴鼻剂中剂量组、醒鼻凝胶滴鼻剂高剂量组、雷诺考特组，每组10只。 根据课题前期卵清白蛋白致敏变应性鼻炎豚鼠模型[4]方法造模。于造模第16天开始，醒鼻凝胶滴鼻剂低、中、高剂量组给予6.88 mg/kg、13.76 mg/kg、27.52 mg/kg的醒鼻凝胶滴鼻剂滴鼻，雷诺考特组给予20 μg/kg的雷诺考特滴鼻，模型组给予等量生理盐水滴鼻，均采用微量加样器双侧鼻腔滴入，2次/d，连续11 d。

1.5取材方法

1.5.1鼻黏膜取材 先腹主动脉放血，后分离鼻骨前的皮肤，再剖开豚鼠双侧鼻腔，最后取下其鼻中隔，并将分离的两侧鼻黏膜剪至1 mm3大小，后立即投入液氮，保存在-80 ℃的超低温冰箱中。

1.5.2肺组织取材 剖开处死的豚鼠胸腔，分离其左、右肺下叶，在20 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)压力下对肺组织灌注4%的多聚甲醛-PBS液，然后将其切割成2 mm3大小的组织块，将组织块经浸泡、石蜡包埋固定和冰冻后切片。

1.6观察指标及方法

1.6.1呼吸区鼻腔黏膜扫描电镜检查 采集的豚鼠鼻腔呼吸区黏膜先经戊二醛固定后，再经四氧化锇固定、脱水及环氧树脂包埋，然后进行切片、染色等，制成鼻腔呼吸区黏膜扫描电镜切片，主要对呼吸区鼻黏膜纤毛、黏液腺等情况进行观察。

1.6.2鼻黏膜及肺组织中IRE1α蛋白表达Western blot法检测 采用相应试剂盒提取细胞总蛋白和核蛋白，并对蛋白定量，进行SDS-PAGE凝胶电泳浓缩分离蛋白质。转膜、染色、封闭、一抗二抗依次孵育、显色、曝光。按照试剂说明书操作，以凝胶成像系统分析结果，将鼻黏膜及肺组织的IRE1α蛋白与同一样本内参 β-actin 的比值作为鼻黏膜及肺组织的IRE1α蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1各组豚鼠呼吸区鼻黏膜形态学表现 空白组呼吸区纤毛柱状上皮细胞和无纤毛柱状上皮细胞皆清晰可见，细胞表面均有微绒毛,纤毛排列整齐、方向一致，中间有数目不等的黏液腺；模型组呼吸区纤毛柱状上皮表面结构有少部分脱落,微绒毛、纤毛缺失，排列混乱，方向不一致，柱状上皮细胞之间的间隙增宽,彼此粘集成束状；醒鼻凝胶滴鼻剂低剂量组柱状上皮细胞表面有部分纤毛结构,排列较混乱，无明显的方向性，部分区域上皮脱落现象有减轻；醒鼻凝胶滴鼻剂中剂量组柱状上皮细胞排列明显好转,较前整齐,细胞表面可见明显的再生纤毛,纤毛有明显的方向性；醒鼻凝胶滴鼻剂高剂量组和雷诺考特组柱状上皮细胞排列较整齐,纤毛生长较好,排列有明显的方向性,并可见腺体分泌细胞。见图1。

图1 各组豚鼠呼吸区鼻腔黏膜扫描电镜形态学表现

2.2各组豚鼠鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达情况 模型组豚鼠鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达水平均明显高于空白组(P均<0.05)，各给药组豚鼠鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)；鼻黏膜中的IRE1α蛋白表达水平降低与醒鼻凝胶滴鼻剂给药浓度呈负相关，两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。 见表1及图2。

表1 各组豚鼠鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达水平比较

A为空白组；B为模型组；C为醒鼻凝胶滴鼻剂低剂量组；D为醒鼻凝胶滴鼻剂中剂量组；E为醒鼻凝胶滴鼻剂高剂量组；F为雷诺考特组图2 Western blot检测各组豚鼠鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达情况

3 讨 论

变应性鼻炎是常见的变态反应性疾病，患病率最高的是儿童[5]，且目前很多治疗方法效果不甚理想，给患儿健康、生活质量及患儿家庭带来了严重影响。中医药在治疗变应性鼻炎方面积累了很多的经验，在辨证的基础上，除了能以口服内治法恢复脏腑功能外，还有外治法调理气血或直达病所[6]，如通过经鼻腔黏膜吸收而发挥全身或局部作用的鼻腔给药制剂[7-9]。醒鼻凝胶滴鼻剂为福建中医药大学附属人民医院治疗变应性鼻炎的新型温敏凝胶型院内制剂，主要由徐长卿、蝉蜕、冰片组成，其中徐长卿祛风化湿、消肿止痒；蝉蜕疏散风热、祛风镇痉，作用于鼻腔起到止嚏之用；冰片为佐，取其辛散清热止痛、通窍止痒之用[10]。陈婧婧等[11]研究证实，醒鼻温敏凝胶剂可以通过纠正血清Th1/Th2细胞因子的失衡，抑制鼻黏膜局部炎症免疫反应。

鼻黏膜纤毛传输系统在呼吸道防御系统中的作用举足轻重，其主要由纤毛柱状上皮及其上方的黏液毯构成[12]，健康人鼻黏膜柱状上皮细胞之间的连接是紧密的，其顶部纤毛分布密集，排列整齐，摆动方向一致。本实验扫描电镜下观察健康豚鼠呼吸区鼻黏膜纤毛整齐，方向一致；变应性鼻炎豚鼠呼吸区纤毛柱状上皮表面结构有少部分脱落,微绒毛、纤毛缺失，排列混乱，方向不一致，柱状上皮细胞之间的间隙增宽,彼此粘集成束状；醒鼻凝胶滴鼻剂各组豚鼠损伤的纤毛传输系统得以一定程度的修复，醒鼻凝胶滴鼻剂高剂量组纤毛生长较好，排列有明显的方向性，并可见腺体分泌细胞。说明醒鼻凝胶滴鼻剂可以改善呼吸区鼻黏膜的纤毛结构。

气道炎性反应是公认的变应性鼻炎发病机制，其炎症信号传导途径通过多种机制与内质网应激中UPR耦联[13]，而哺乳动物中UPR主要由分子伴侣蛋白和包括肌醇需求酶1(IRE1)的3个传感器介导[14]，IRE1是Ⅰ型内质网跨膜蛋白，具有丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶活性，也具有核酸内切酶的活性。IRE1包括IRE1α和IRE1β，IRE1α表达于大多数的组织细胞，而IRE1β主要存在于肠道的上皮细胞[15]。IRE1在高等生物中以IRE1α的形式存在，是3个感受器中最保守的一个，同时也具有激酶和核酸内切酶双重酶活性[16]。本实验中变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达水平均明显高于空白组，证实模型复制成功，存在气道炎性反应状态；醒鼻凝胶滴鼻剂各剂量组鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达水平均明显低于模型组，说明醒鼻凝胶滴鼻剂可能通过调节IRE1α的表达减轻变应性鼻炎气道炎性反应，从而发挥治疗变应性鼻炎的作用。综上，醒鼻凝胶滴鼻剂可能通过改善豚鼠呼吸区鼻黏膜纤毛结构、降低气道炎性反应相关的鼻黏膜和肺组织中IRE1α蛋白表达水平发挥治疗变应性鼻炎的作用，但其更进一步的机制仍需更多的研究去证实。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。