显齿蛇葡萄叶代用茶总黄酮以二氢杨梅素计的试验验证

张学英

（湘西自治州食品药品检验所，湖南吉首 416000）

显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），是种子植物门双子叶植物纲葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄种。显齿蛇葡萄是一种野生藤本植物，广泛分布于我国湖南、湖北、贵州、福建、广西等省份。2013 年12 月24 日，原国家卫生和计划生育委员会，将显齿蛇葡萄叶纳入可用于食品生产加工的新食品原料管理[1]，从此显齿蛇葡萄叶代用茶（即莓茶或藤茶）纳入我国食品生产许可市场准入发证范围，俗称藤茶、莓茶、茅岩莓、神仙草等。2019 年国家卫健委将显齿蛇葡萄叶列入最新版食药同源目录[2]，由此显齿蛇葡萄叶开启食药两用新用途的广大发展空间。近年来显齿蛇葡萄叶代用茶（即莓茶或藤茶）产业因投入少、周期短、见效快、市场需求大、产品延伸研究空间大等特点，己成为湖南省张家界市和湘西州（特别是永顺县和凤凰县）脱贫攻坚和乡村振兴大力扶持项目。2020 年湖南省永顺县成功申请“永顺莓茶”农产品地理标志[3]，给永顺县莓茶产业带来了更大发展空间。

显齿蛇葡萄叶代用茶（即莓茶或藤茶）其食药两用价值研究较多，其藤茶研究有藤茶栽培与开发利用[4]、藤茶有效成分及功效的研究进展[5]；其药用价值研究[6-9]；其作为代用茶研究[10-11]；另有显齿蛇葡萄叶代用茶检测方法研究[12-16]。自然界中许多植物都含有天然黄酮类物质，总黄酮为黄酮类物质的总称，常见黄酮类物质有芦丁、斛皮素、二氢杨梅素、陈皮苷、葛根素等，但植物各异，则其总黄酮含量及主要黄酮单体成分也不尽相同，如有的植物多含芦丁而有的则不含芦丁等，不同植物黄酮类物质各异且各有特色。显齿蛇葡萄被称为“天然黄酮之王”，是自然界中总黄酮含量较多的一种植物，其主要特征物质是二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素等。经查资料食品中总黄酮的检测方法有保健食品中总黄酮的测定（以芦丁计）[17]、食品中总黄酮检测法（以芦丁计）[18-25]等。然而显齿蛇葡萄叶代用茶（即莓茶或藤茶）的总黄酮应以什么计？或者说以芦丁计是否合理？却没有相关文献资料。笔者通过显色剂选择、分光光度计光谱扫描和液相色谱验证等试验，旨在验证显齿蛇葡萄叶代用茶中总黄酮以二氢杨梅素计的科学性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试剂甲醇（HPLC）；70%甲醇（自配）；乙腈（HPLC）；磷酸（HPLC）；0.1%磷酸水溶液（自配）；乙腈+0.1%磷酸水溶液（15+85，自配）；无水乙醇（HPLC、AR）；95%乙醇（AR）；70%乙醇（自配）；醋酸钾（AR）；冰醋酸（AR）；98.2 g/L 醋酸钾水溶液（100 ml 中含4 ml 冰醋酸，自配）；三氯化铝（AR）；25 g/L 三氯化铝水溶液（自配）；硝酸铝（AR）；100 g/L 硝酸铝水溶液（自配）；亚硝酸钠（AR）；50 g/L 亚硝酸钠水溶液（自配）；氢氧化钠（AR）；40 g/L 氢氧化钠水溶液（自配）。

1.1.2 仪器高效液相色谱仪（带自动进样装置）、UV-2550 紫外可见分光光度计、 BSA-224S 感量0.000 1 g 分 析 天 平、JY502 感 量0.01 g 天 平、KQ5200V 型超声波清洗器、常用玻璃器皿等。

1.1.3 标准品及标准溶液标准溶液Ⅰ（二氢杨梅素标准溶液620 μg/mL）：上海源叶生物科技有限公司生产二氢杨梅素（CAS 号27200-12-0，分子式C15H12O8，纯度99.5%），称取干燥恒重二氢杨梅素0.015 5 g 于小烧杯中，用色谱纯甲醇溶解定容至25 mL 棕色容量瓶中混匀静置，转入试剂瓶中，称重-18℃冷冻贮存，使用时放至常温称重并用色谱纯甲醇补至衡重。标准溶液Ⅱ（二氢杨梅素标准溶液62 μg/mL）：标准溶液Ⅰ用95%乙醇溶解按1 ∶10 稀释即可，冷藏贮存。标准溶液Ⅲ（杨梅苷标准溶液75 μg/mL）：上海源叶生物科技有限公司生产杨梅苷（CAS 号17912-87-7，分子式C21H20O12，纯度98.5%），称取干燥恒重杨梅苷0.007 5 g 于小烧杯中，用色谱纯甲醇溶解定容至100 mL 棕色容量瓶中混匀静置，转入试剂瓶中，称重-18℃冷冻贮存，使用时放至常温称重并用色谱纯甲醇补至衡重。标准溶液Ⅳ（芦丁标准溶液124 μg/mL）：上海安谱生产的芦丁标准品（CAS 号153-18-4，分子式C27H30O16，纯度99.3%），称取干燥恒重芦丁0.012 4 g 于小烧杯中，用95%乙醇溶解定容至100 mL 棕色容量瓶中混匀静置，转入试剂瓶中，冷藏贮存。

1.1.4 试验样品试验样品来源于湖南省市场监督管理局。科研样品主要收集2020 年湖南省永顺县、凤凰县、古丈县、张家界市、江华县、桂东县等不同地域莓茶或藤茶成品，有人工种植和野生莓茶或藤茶成品。样品检测前在实验室进行简单处理：60℃恒温复干1 h →粉碎→备用。

1.2 方 法

1.2.1 分光光度计总黄酮检测方法参照张学英[16]的方法，精确称取约0.5 g 显齿蛇葡萄叶代用茶粉末样品置于100 mL 比色管中，加入70%乙醇水溶液50 mL 浸润混匀，在50℃水浴超声提取30 min，趁热过滤至100 mL 容量瓶中，如此重复提取2 次，合并提取液并用70%乙醇定容至100 mL，摇匀静置，提取液用蒸馏水按2 ∶25 稀释备用。精确吸取标准溶液Ⅱ0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 于10 mL 比色管中，二氢杨梅素标曲系列浓度为0、3.1、6.2、12.4、18.6、24.8 μg/mL；精确吸取样品处理液1.0 mL 于10 mL 比色管中；在标曲系列和样品比色管中加入少量蒸馏水约至5 mL，再加入25 g/L 三氯化铝2 ml 摇匀放置5 min，再加入98.2 g/L 醋酸钾2 mL，用蒸馏水定容摇匀，显色反应呈浅黄色，15 min 后于294 nm 波长处测定吸光度值。总黄酮含量计算公式C=（C'×10）×F×100/ （m×V1/V2×1 000），式中C为总黄酮含量（g/kg），C'为样品处理液检测浓度（μg/mL），10 为比色管定容体积（mL），m 为代用茶的质量数（g），V1为比色用处理液体积（mL），V2处理液定容体积（mL），F 为处理液稀释倍数，1 000、100 为单位换算系数。

1.2.2 液相色谱黄酮单体成分检测方法参照文献中的方法[26]，准确称取显齿蛇葡萄叶代用茶粉末样品约0.5 g 至50 mL 比色管中，准确加入70%甲醇水溶液15 mL 旋涡混匀，再准确加入70%甲醇水溶液15 mL 沿壁洗净，称重记数，置于50℃超声仪中超声提取30 min，取出冷却至室温再次称重，并用纯甲醇补至超声提取前的重量（即衡重或衡定体积），超声提取液用蒸馏水进行1 ∶10 稀释，稀释液混匀过0.45 μm 滤膜，待上机检测二氢杨梅素含量。标准溶液Ⅰ用70%甲醇稀释成浓度为0、62、155、310、465、620 μg/mL 标曲系列待上机检测，由二氢杨梅素浓度和峰面积制作标准曲线及计算方程。液相色谱检测条件：色谱柱C18（4.6×250 mm，5 μm）或等效柱；标曲系列进样量20 μL；样品进样量10 μL；检测柱温35℃；检测时间约41 min；流动相A 为0.1%磷酸水溶液，流动相B 为乙腈，按1～12 min 流动相A 为85%、12～30 min 流 动 相A 为85%～70%、30～41 min流动相A 为85%进行梯度洗脱；全波长检测，分别在290 nm 和350 nm 波长处分析二氢杨梅素和杨梅苷的含量。二氢杨梅素含量计算公式C=（C'×V×F）/（1 000×100×m），式中C 二氢杨梅素含量（g/kg）；C '为样品处理液中二氢杨梅素浓度（μg/mL）；V 为70%甲醇提取液体积数（mL）；F 为稀释倍数；m 为样品称样量（g）；1 000、100 为单位换算系数。

2 结果与分析

2.1 显色剂的选择验证

食品中总黄酮检测分光光度计法常用显色剂有三氯化铝-醋酸钾和硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠等方法，本试验通过3 种不同浓度样品提取液不加显色剂、加三氯化铝显色剂和加硝酸铝显色剂进行光谱扫描。科研样品2020KY094 按1.2.1 方法进行提取和稀释，分别吸取样品提取稀释液0.5、1.0、2.0 mL置于9 支10 mL 比色管中，共3 组9 管，其中第一组3 管加蒸馏水定容（即不加显色剂）；第二组3 管按1.2.1 方法加入三氯化铝显色剂；第三组3 管分别加入蒸馏水约至4 mL，再加入100 g/L 硝酸铝水溶液0.4 mL 轻摇放置6 min，再加入50 g/L 亚硝酸钠水溶液0.4 mL 轻摇放置6 min；再加入40 g/L 氢氧化钠水溶液4 mL，加水定容摇匀放置15 min，将3 组9 管溶液在200～600 nm 进行光谱扫描，光谱扫描比较图见图1～图3。

图1 不同浓度样品提取液不加显色剂光谱扫描比较

由图1 可见，不同浓度样品提取液不加显色剂光谱扫描图在约294 nm 处有最大吸收峰，峰形较明显突出，但约340 nm 处有平缓拖尾峰，在约250～380 nm 间吸收峰波长跨度较大，且吸收峰对称性较差；由图2 可见，不同浓度样品提取液加入三氯化铝显色剂光谱扫描图在294 nm 处有最大唯一吸收峰，峰形对称无拖尾峰，图2 和图1 大体相近，但图2 吸收峰唯一更明显；由图3 可见，不同浓度样品提取液加入硝酸铝显色剂后光谱扫描图变化较大，并无成形吸收峰，故不宜选择硝酸铝显色剂。由此，论证显齿蛇葡萄叶代用茶的总黄酮检测显色剂用三氯化铝-醋酸钾，而不可用硝酸铝，检测波长选择294 nm。

图2 不同浓度样品提取液加三氯化铝显色剂光谱扫描比较

图3 不同浓度样品提取液加硝酸铝显色剂光谱扫描比较

2.2 光谱扫描验证试验

2.2.1 样品提取液光谱扫描图科研样品2020KY094按1.2.1 方法进行提取和稀释，各吸取样品稀释液1 mL 分别置于2 支10 mL 比色管中，其中1 支比色管按1.2.1 显色方法进行显色反应，放置15 min 后进行光谱扫描；另1 支比色管用蒸馏水定容摇匀，放置15 min 后进行光谱扫描。同浓度样品提取液加显色剂与不加显色剂光谱扫描比较图见图4。

图4 同浓度样品提取液加显色剂与不加显色剂光谱扫描比较

分别吸取样品稀释液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 按1.2.1 方法进行显色反应，放置15 min 后进行光谱扫描。不同浓度样品提取液加显色剂光谱扫描比较见图5。

图5 不同浓度样品提取液加显色剂光谱扫描比较

由图1 和图4 可见，样品不加显色剂其光谱图在294 nm 左右有最大吸收峰，但在340 nm 左右有平缓不明显吸收峰，且2 个吸收峰之间峰形相连；由图2、图4 和图5 可见，样品加显色剂后光谱图在294 nm有唯一最大吸收峰且前后无其他吸收峰，峰形对称完美，样品浓度与其吸收峰Abs 值大小成一定正比例关系。由此论证显齿蛇葡萄叶代用茶的总黄酮检测波长选择294 nm，显色剂用三氯化铝-醋酸钾。

2.2.2 二氢杨梅素标准溶液光谱扫描准确吸取标准溶液Ⅱ各1.0 mL 分别置于2 支10 mL 比色管中，其中一支比色管按1.2.1 标曲系列显色方法进行显色反应，放置15 min 后进行光谱扫描；另一支比色管用蒸馏水定容摇匀，放置15 min 后扫描，同浓度二氢杨梅素标准溶液加显色剂与不加显色剂光谱扫描比较见图6。准确吸取标准溶液Ⅱ0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL（浓度分别为3.1、6.2、12.4、18.6、24.8 μg/mL），按1.2.1 将标准曲线系列进行显色反应，放置15 min 后进行光谱扫描，不同浓度二氢杨梅素加显色剂光谱扫描比较见图7。

图6 同浓度二氢杨梅素标准溶液加显色剂与不加显色剂光谱扫描比较

图7 不同浓度二氢杨梅素标准溶液加显色剂光谱扫描比较

由图6 和图7 可见，二氢杨梅素标液不加显色剂在294 nm 左右有最大吸收峰，但在340 nm 左右有平缓不明显吸收峰，且两个吸收峰之间峰形相连，而二氢杨梅素标液加显色剂在294 nm 有唯一最大吸收峰且前后无其他吸收峰，峰形对称完美，二氢杨梅素标准曲线系列浓度与其吸收峰Abs 值大小成一定正比例关系。比较图1、图4 和图6 光谱图较相似，再比较图2、图5 和图7 光谱图很相似，说明显齿蛇葡萄叶代用茶的总黄酮主要单体成分为二氢杨梅素。由此论证显齿蛇葡萄叶代用茶的总黄酮检测波长选择294 nm，显色剂用三氯化铝-醋酸钾，定性定量以二氢杨梅素计。

2.2.3 芦丁标准溶液光谱扫描准确吸取标准溶液Ⅳ各1.0 mL 分别置于2 支10 mL 比色管中，其中一支比色管按1.2.1 显色方法进行显色反应，放置15 min后扫描；另一支比色管用蒸馏水定容摇匀，放置15 min 后扫描。同浓度芦丁标准溶液加显色剂与不加显色剂光谱扫描比较见图8。

图8 同浓度芦丁标准溶液加显色剂与不加显色剂光谱扫描比较

准确吸取标准溶液Ⅳ0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL（浓度分别为6.2、12.4、24.8、37.2、49.6 μg/mL），按1.2.1 将标准系列进行显色反应，放置15 min 后进行光谱扫描，不同浓度芦丁标准溶液加显色剂光谱扫描比较见图9。

图9 不同浓度芦丁标准溶液加显色剂光谱扫描比较

由图8 可见，未加显色剂的芦丁标准溶液在约258 nm 和363.5 nm 波长处有吸收峰，且两峰间峰形相连；加入显色剂的芦丁标准溶液在269.5 nm 和409.5 nm 有较明显吸收峰，且两峰间峰形相连；同浓度芦丁标准溶液加与不加显色剂光谱图峰形相似，芦丁标液加入显色剂后吸收峰延后。由图9 可见，芦丁浓度与其吸收峰Abs 值大小成一定正比例关系。由图1、图2、图4 和图5 可见，显齿蛇葡萄叶代用茶中不含或含极少量的芦丁。由此反向论证显齿蛇葡萄叶代用茶的总黄酮检测定性定量不宜以芦丁计。

2.2.4 样品、二氢杨梅素和芦丁光谱扫描通过以上2.2.1～2.2.3 试验，再次分析比较样品、二氢杨梅素和芦丁加显色剂与不加显色剂光谱扫描图，见图10、图11 和图12。

图10 样品和二氢杨梅素标准溶液不加显色剂光谱扫描比较

图11 样品和二氢杨梅素标准溶液加显色剂光谱扫描比较

由图10～图12 可见，样品和二氢杨梅素标准溶液不加显色剂在294 nm 有明显吸收峰，340 nm 波长处有不明显吸收峰，且两峰间峰形相连；样品和二氢杨梅素标准溶液加入显色剂在294 nm 波长有唯一明显最大吸收峰；芦丁标准溶液加入显色剂在269.5 nm和409.5 nm 有吸收峰，且两峰间峰形相连；由图10～图12 更直观更科学可见，显齿蛇葡萄叶代用茶中几乎不含或含极少量的芦丁，反之主要黄酮单体成分是二氢杨梅素。由此，科学论证显齿蛇葡萄叶代用茶中总黄酮检测应以二氢杨梅素计而不宜以芦丁计，检测波长为294 nm，显色剂用三氯化铝-醋酸钾。

图12 样品、二氢杨梅素标准溶液和芦丁标准溶液加显色剂光谱扫描比较

2.3 液相色谱法验证

显齿蛇葡萄叶代用茶特征指标检测研究，主要检测其黄酮单体成分：二氢杨梅素、杨梅苷和杨梅素。同时也对显齿蛇葡萄叶代用茶是否含有芦丁及含杨梅苷（因两者出峰时间相近）的情况进行验证。科研样品2020KY094 按1.2.2 方法进行样品前处理。液相色谱法验证试验图谱有杨梅苷和芦丁标液液相色谱图、杨梅苷和芦丁标液液相光谱图、样品液相色谱图、样品加杨梅苷标液液相色谱图以及样品加芦丁标液液相色谱图，见图13～图19。

图13 杨梅苷标液液相色谱图

图19 样品加芦丁标液液相色谱图

图14 芦丁标液液相色谱图

图15 杨梅苷液相光谱图

图16 芦丁液相光谱图

图17 样品液相色谱图

图18 样品加杨梅苷标液液相色谱图

通过以上验证试验，得出结论：显齿蛇葡萄叶代用茶中总黄酮以二氢杨梅素计，用三氯化铝-醋酸钾显色反应，在294 nm 波长有唯一明显最大吸收峰，且二氢杨梅素浓度与吸光度值成正比例关系，符合朗伯比耳定律[16]。

2.4 莓茶或藤茶样品检测

湖南省市场监督管理局科技项目（2020KJJH72）部分科研样品，按1.2.1 和1.2.2 检测方法进行总黄酮和二氢杨梅素指标检测，检测结果见表1。

表1 莓茶或藤茶样品检测结果

由表1 得出，显齿蛇葡萄叶代用茶总黄酮（以二氢杨梅素计）和黄酮单体物质二氢杨梅素含量非常高，总黄酮（以二氢杨梅素计）高达300～400 g/kg，是自然界植物中真正“黄酮之王”；二氢杨梅素含量达200～300 g/kg，是显齿蛇葡萄叶代用茶中黄酮单体含量最高的物质，其中，二氢杨梅素含量占总黄酮约70%～80%。显齿蛇葡萄叶为二氢杨梅素深加工首选原材料。

3 结 论

通过显色剂选择、分光光度计光谱扫描、液相光谱、液相色谱和样品加标等验证试验，表明显齿蛇葡萄叶代用茶（即莓茶或藤茶）中总黄酮单体成分主要是二氢杨梅素，其中二氢杨梅素含量占总黄酮约70%～80%，且几乎不含或极少含芦丁，结论显齿蛇葡萄叶代用茶（即莓茶或藤茶）中总黄酮以二氢杨梅素计，不宜以芦丁计，用三氯化铝-醋酸钾显色反应，在294 nm 波长处检测。通过分析检测莓茶或藤茶中总黄酮（以二氢杨梅素计）含量高达300～400 g/kg，其中二氢杨梅素含量高达200～300 g/kg，二氢杨梅素含量占总黄酮约70%～80%，为自然界黄酮含量极高的植物之一，植物界真正的“黃酮之王”，同时显齿蛇葡萄叶可作为二氢杨梅素深加工提纯最佳原材料。