基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶对放化疗后骨髓抑制的机制研究

王鑫虹

摘要：基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶（Gui-Lu-Er-Xian-Jiao， GLEXJ）治疗肿瘤放化疗后骨髓抑制（bone marrow suppression，BMS）的作用机制。运用TCMSP、TCMID数据库获取活性成分和作用靶点，在GeneCard、DisGeNET等数据库检索疾病靶点，成分靶点与疾病靶点映射后利用Cytoscape软件和STRING数据库构建GLEXJ“成分-靶点-疾病”调控网络与PPI网络，metescape数据库进行GO和KEGG富集分析。筛选得GLEXJ 86个活性成分，度值较高的化合物有槲皮素、山萘酚、豆甾醇、β-谷甾醇等，其作用于ESR1、RELA、EGFR、FOS、MAPK8、CCND1、NCOA2、NR3C1等89个关键靶点，这些靶点主要富集在MAPK、TNF、PI3K-Akt等与BMS相关的通路上。GLEXJ治疗BMS的作用体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点，其机制可能与调控细胞增殖、调节细胞周期、调控氧化应激等多方面相关，本研究为后续研究提供一些思路和借鉴。

关键词：骨髓抑制;网络药理学;龟鹿二仙胶;作用机制;

近年来我国肿瘤的发病率不断攀升，而治疗手段中的多数抗癌药物和放、化疗在灭杀肿瘤细胞同时会让正常骨髓细胞受损，骨髓抑制是放、化疗后常见的限制性毒性反应，不但令患者身体状况恶化，甚至导致严重感染而增加死亡风险。中药作为辅助用药，以其疗效确切、副作用小等特點，在减缓BMS方面表现出良好的前景。

龟鹿二仙胶（GLEXJ）由龟板、鹿角胶、人参和枸杞组成，具有补益肝肾、填精益髓、助阳益气之功。有研究表明，GLEXJ能促进骨髓基质干细胞增殖并诱导其向成骨细胞分化[1];能减少细胞周期的阻滞，逆转化疗所致的骨髓造血干细胞（HSCs）衰老[2]。然而GLEXJ成分较为复杂，其治疗BMS的物质基础和作用机制尚未完全阐明。本研究将采用网络药理学方法初步阐释GLEXJ治疗BMS可能的作用机制，同时为临床更好地诊治BMS提供了一些参考与新思路。

1 材料与方法

1.1 成分检索及筛选靶点

运用TCMSP、TCMID数据库检索鹿角胶、龟板、人参、枸杞子的化学成分及作用靶点，根据口服生物利用度（0B）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18筛选各活性成分。利用PubChem数据库得成分的SDF格式文件，导入至Swiss Target Prediction平台，进行反向药效团匹配预测化合物靶点，并设定“Probability>0.6”[6]的靶点作为关联性较高的潜在靶点，经规范、去重后得相应的靶点。

1.2 疾病靶点的获取及分子网络的构建分析

以“Bone Marrow Suppression”为关键词， 在DisGeNET、DiGSeE、GeneCards数据库获得BMS相关基因，剔除重复靶点，获取BMS相关的唯一靶点基因。利用Venny软件获取GLEXJ-BMS的交集靶点，通过Cytoscape软件构建GLEXJ“活性成分-靶点-疾病”网络，利用Network analyzer功能对网络中的拓扑属性进行分析。利用String数据库和Cytoscape软件构建PPI网络，根据各个节点的自由度，介度中心性和接近中心性等参数值对获得的映射网络进行筛选，获取得分前十的核心蛋白。

1.3 GO功能富集及KEGG通路富集分析

利用metascape数据库对核心靶点参与的生物学过程、信号通路进行分析，设置P≤0.01，获得GO功能及KEGG信号通路富集分析结果，利用 R语言绘制富集分析图。

2 结果

2.1 化合物成分的获取及筛选

通过TCMSP和TCMID数据库共获GLEXJ药物成分400个。经OB≥30%、DL≥0.18筛选后得有效成分共86个，其中人参22个，枸杞子45个，龟板20个，鹿角胶2个。利用TCMSP和Swiss Target Prediction平台共获取647个蛋白靶点，其中人参靶点为256个，枸杞子靶点为364个，龟板靶点为27个，鹿角胶靶点为0个，当中枸杞子成分槲皮素（quercetin）拥有154个潜在靶点。

2.2 疾病靶点的筛选及分子网络构建与分析

在GeneCards、DisGeNET、DigSee数据库得BMS相关靶点分别为6438个、39个、10个，3个数据库的结果合并、去重后得到6 448个靶点基因。将647个成分靶点与6448个BMS靶点进行映射，得共同靶点89个，借助Cytoscape软件构建“活性成分-靶点-疾病网络”，其中度值最大的5个成分为槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黄豆黄素。将89个交集靶点导入至STRING数据库，并利用 Cytoscape软件进行分析，从而获取PPI网络图，图中节点表示蛋白，边表示功能相关性，度值大小决定节点面积大小，节点面积越大表示蛋白在网络中所起的作用越大。筛选相关网络拓扑参数，其中居Degree值前十位的靶点依次为：ESR1、RELA、FOS、MAPK8、EGFR、CCND1、NR3C1、NCOA2、PRKCA、APP，这10个靶点被认为是GLEXJ治疗BMS的核心靶点。

2.3 GO功能分析及KEGG富集分析

将89个交集靶点应用metascape数据库进行相关富集分析，设置P≤0.01，依据P值筛选排名前20的GO-BP与KEGG富集结果，绘制富集分析图。共得到GO富集条目1541个，其中，生物过程条目1 372个，主要涉及调节细胞生长、细胞对激素刺激的反应等;分子功能条目104个，主要涉及转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合等;细胞成分条目65个，主要涉及膜筏、膜微区等。共得139个KEGG富集条目，其中前20条信号通路依据KEGG BRITE层次分类，与疾病通路相关有16条，信号传导相关通路3条，1条与细胞过程相关通路。提示GLEXJ能通过多种疾病通路、信号通路及代谢通路对BMS发挥作用。