沸石咪唑酯骨架化合物ZIF-8强化羧肽酶A降解能力的研究

马 蕾，左晶晶，李雅琪，史巧巧，盛建国，孔德昭

(江苏科技大学 粮食学院，镇江 212100)

沸石咪唑酯骨架化合物(zeolitic imidazolate frameworks，ZIFs)是以有机咪唑酯为连接配体的一种金属有机骨架化合物材料.这类化合物的孔径大小可以设计，结构灵活[1]，具有高比表面积、开放的金属位点、优秀的生物相容性、卓越的化学稳定性和热稳定性，可以作为一种优良的酶固定试剂[2-3].其中沸石咪唑酯骨架化合物ZIF-8(zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8)是目前研究最多、应用最广的ZIFs材料之一，它的拓扑结构与方钠石(sodalite，SOD)类似，每个Zn2+都连接4个2-甲基咪唑[3-4]，从而产生一个直径为1.16 nm的笼形结构.该笼形结构通过狭窄的六元环笼口相互连接，其晶体尺寸可以在50 nm至100 μm甚至是更大的范围内变化[5].赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是一种由赭曲霉、硫色曲霉及纯绿青霉等霉菌产生的有毒次级代谢产物[6]，化学稳定性和热稳定性很高，在一般的食品生产与加工过程中很难被去除.OTA的脂溶性导致它可以在生物体中累积[7]，具有严重的肾毒性、肝毒性、免疫毒性与致畸性等，被国际癌症研究中心(international agency for research on cancer，IARC)归为Class 2B类致癌物[8].它对大部分农产品都具有污染性，在多种食品、饮料中都有明显的分布[9-11].目前OTA的脱毒主要有吸附和降解两种途径，吸附与理化降解方法的脱毒率低，可能导致化学残留或营养物质破坏[12].而生物降解技术具有条件温和、不损害食品价值、效率高、无污染等优势.其中生物酶降解更具有亲和力强、经济高效、转化不可逆、无二次污染等优点.

羧肽酶是一种能有效降解OTA的生物降解酶，其中锌依赖性羧肽酶A(carboxypeptidase A，CPA)[13]可以特异性的将OTA降解成为OTα与L-β-苯丙氨酸，从而大大减弱其毒性[12,14-16]，但在使用中存在稳定性较差、重复利用性低等缺点，从而在实际应用中受到很大限制.目前已有大量的研究证明ZIFs材料通过不同方法与酶复合后具有提高酶的稳定性、重复利用性以及催化性能的能力[17].文中以ZIF-8作为酶固定化的载体制备了ZIF-8/CPA复合物，研究其在不同条件下的降解活性变化趋势，并对实际样品中OTA进行降解实验.

1 实验

1.1 实验材料与设备

2-甲基咪唑、乙酸锌、三(羟甲基)氨基甲烷、L-苯丙氨酸、马尿酸、牛血清白蛋白均购自上海麦克林生化科技有限公司；Z-Phe-Leu、L-亮氨酸、水合茚三酮、氯化镉均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；牛胰羧肽酶A从Sigma公司所购；赭曲霉毒素A购自北京世纪奥科生物技术有限公司；考马斯亮蓝G250购自上海金穗生物科技有限公司；赭曲霉毒素A ELISA 检测试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司.

所用仪器：紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Vortex Mixer，Kylin-Bell Lab Instruments；NEXUS 870FT红外光谱仪.

1.2 实验方法

1.2.1 材料制备

(1)ZIF-8材料的制备

称取2-甲基咪唑6.570 g，溶解于40 mL超纯水中，配制2-甲基咪唑浓缩液；称取4.390 g乙酸锌溶解于40 mL超纯水中，配制乙酸锌溶液.

制备时使用移液枪准确吸取2-甲基咪唑浓缩液400 μL，吸取乙酸锌溶液4 mL，混合于20 mL小瓶中，加入超纯水至总体积为10 mL，均匀搅拌5 min，然后静置老化5 h，10 000 r/min离心收集沉淀于室温下自然干燥.

(2)ZIF-8负载羧肽酶A复合物的制备

制备时使用移液枪准确吸取2-甲基咪唑浓缩液400 μL，吸取乙酸锌溶液4 mL，混合于20 mL小瓶中，加入一定量的羧肽酶溶液，加入超纯水至总体积为10 mL，均匀搅拌5 min，然后静置老化5 h，10 000 r/min离心收集沉淀和上清液，水洗一次后再次离心收集沉淀和上清液，沉淀室温下自然干燥.

使用考马斯亮蓝测定上清液中蛋白质含量，确定不同CPA添加量条件下ZIF-8材料对CPA的负载情况，确定最佳负载值.羧肽酶A的负载率计算如下：

(1)

式中：G为负载率，%；m为反应体系中CPA的含量，μg；n为上清液中CPA的含量，μg.

1.2.2 材料表征

(1)结构形态表征

利用傅里叶红外变换光谱，分别对ZIF-8、CPA及ZIF-8/CPA复合物的红外光谱结果进行分析.

(2)生物活性表征

因为羧肽酶A可以特异性的分解OTA中的酰胺键，因此选用Z-Phe-Leu作为反应底物，采用改良的镉-茚三酮法[18]，分别测定CPA与ZIF-8/CPA对Z-Phe-Leu的降解性能.

在浓度为8 mmol/L体积为1.8 mL的底物溶液中加入0.2 mL相同CPA含量的游离CPA或ZIF-8/CPA复合物溶液，35 ℃恒温震荡孵育反应，10 min后取50 μL的反应液，加水稀释至1 mL，再加入2 mL的镉-茚三酮试剂混合后用涡旋震荡仪混匀，84 ℃下水浴加热5 min,冷却到室温后进行紫外光谱扫描测量507 nm处的吸光值，分析检测结果.

1.2.3 复杂体系下酶活性能的研究

由于食品生产加工过程存在复杂的体系条件，为验证ZIF-8/CPA复合物对CPA降解性能的强化作用，分别在不同温度、pH值、有机试剂含量、保存时间和重复使用次数条件下，以Z-Phe-Leu作为反应底物，分别测定相同酶含量条件下游离CPA及ZIF-8/CPA复合物的酶活性能.配制20、40、60、80、100、120和140 μmol/L的L-亮氨酸溶液，加入2 mL的镉-茚三酮试剂，84 ℃水浴加热5 min后冷却至室温并测量吸光值，制备L-亮氨酸标准溶液曲线.

(1)不同温度下游离CPA 与ZIF-8/CPA复合物酶活性能的研究

使用pH为7.5，浓度为0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液配制8 mmol/L的底物溶液，分别在15、25、35、45、55和65 ℃条件下进行孵育，加入相同酶含量的游离CPA或ZIF-8/CPA复合物溶液，恒温震荡反应10 min后，测定生成物的含量.

(2)不同pH值下游离CPA 与ZIF-8/CPA复合物酶活性能的研究

调节磷酸钾缓冲液pH值分别为2.6、4.5、6.0、7.5和9.0，配制底物溶液，加入相同酶含量的游离CPA或ZIF-8/CPA复合物溶液，35 ℃恒温震荡反应10 min，测定生成物的含量.

(3)不同有机试剂含量(乙醇)下游离CPA 与ZIF-8/CPA复合物酶活性能的研究

分别使用pH 7.5的15%、20%、30%、40%、50%比例的乙醇/磷酸钾缓冲液溶液配制底物溶液，分别加入相同酶含量的游离CPA或ZIF-8/CPA复合物溶液，35 ℃恒温震荡反应10 min后，测定生成物的含量.

(4)不同储存时间下游离CPA与ZIF-8/CPA复合物酶活性能的研究

将游离CPA与ZIF-8/CPA复合物在4 ℃的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.5)进行储存，在储存2、7、14、30、65 d后分别取出相同酶含量的游离CPA和ZIF-8/CPA复合物溶液对底物进行孵育反应，35 ℃恒温震荡反应10 min后，测定生成物的含量.

(5)不同循环使用次数下游离CPA 与ZIF-8/CPA复合物酶活性能的研究

在超滤管内进行底物孵育反应，加入相同酶含量的游离CPA或ZIF-8/CPA复合物溶液，35 ℃恒温震荡反应10 min后，测定生成物含量.超滤去除剩余反应液，使用磷酸钾缓冲液重悬沉淀并再次超滤，加入底物重复孵育反应，测定生成物含量.对游离CPA和ZIF-8/CPA复合物分别进行10次重复检测.

(6)最优条件下对CPA 与ZIF-8/CPA的酶活测定

在游离CPA最适温度、pH、有机试剂含量、储存时间与循环使用次数条件下，按照1.2.2节生物活性表征部分描述的检测方法，每隔1 min取50 μL的反应液，用镉-茚三酮法测量游离CPA 与ZIF-8/CPA复合物的酶活性能，计算方法如下：

(2)

式中：W为酶活，μmol/min；x为L-亮氨酸浓度，μmol/L；y为酶分解底物的总体积，L；f为稀释倍数；t为反应时间，min.

1.2.4 ZIF-8/CPA复合物对样品中OTA降解性能的研究

选择西瓜汁和梨汁作为实际样品，在新鲜制备的西瓜汁和梨汁中加入OTA标准品至最终浓度为250 ng/mL.取5份上述样品，每份2 mL，分别加入相同酶含量的游离CPA、ZIF-8/CPA、游离CPA与ZIF-8材料混合物、纯ZIF-8材料及空白对照组.样品35 ℃恒温震荡降解，在10、20、30与45 min时分别取样，用酶联免疫检测试剂盒进行OTA含量检测，每组样品均设置3个平行样，并且计算RSD值.

2 结果与分析

2.1 材料表征

2.1.1 ZIF-8对CPA的负载率

在ZIF/CPA复合物制备过程中分别加入10、24、32.5、40和60 mg的CPA.使用考马斯亮蓝法测定上清液的合并液中残余游离酶含量，计算结果见图1.随着CPA加入量的增加，ZIF-8对CPA的负载率逐渐下降，可能是由于CPA加入量超过ZIF-8的负载量而引起的.而随着CPA加入量的增加，ZIF-8对CPA的负载量先上升，在加入量为24.00 mg时达到峰值，随着加入量的进一步增加，过高的CPA可能自身发生聚集，从而影响负载效率，使得负载量发生下降.产物水洗后上清液中不含蛋白，证明CPA完全负载在ZIF-8材料中，没有附着现象.最佳合成条件为CPA加入量24.00 mg，此时ZIF-8对CPA负载量为16.81 mg，负载率为70.03%，ZIF-8材料的重量与CPA负载重量质量比为13 ∶2.

图1 ZIF-8共沉淀法对CPA负载情况的测定Fig.1 Loading capacity of ZIF-8 to CPA

2.1.2 ZIF-8及ZIF-8/CPA的表征

(1)结构形态表征

对ZIF-8、CPA及ZIF-8/CPA的傅里叶红外光谱分析结果如图2.CPA在1 649 cm-1和1 541 cm-1位置处对应于C=O伸缩振动，与文献中的描述相一致[19]，1 640 cm-1至1 660 cm-1范围内特征峰对应于蛋白质酰胺Ⅰ带振动；ZIF-8在693 cm-1位置处的谱带对应于2-甲基咪唑环的平面外共混[19-20]，在836.3 cm-1至1 307.9 cm-1的范围内出现的特征峰对应2-甲基咪唑的面内弯曲[19,21].ZIF-8/CPA复合物在1 660 cm-1处的酰胺Ⅰ带特定峰出现，表明蛋白质与金属氧化物之间存在相互作用[22]，ZIF-8材料对CPA进行了有效的负载，生成ZIF-8/CPA复合物.蛋白质羰基与ZIF-8的Zn2+离子配位，调节ZIF-8与酶的嵌入方式.

图2 ZIF-8、CPA和ZIF-8/CPA的傅里叶红外光谱表征Fig.2 Fourier infrared spectroscopy results of ZIF-8,CPA,and ZIF-8/CPA

(2)生物活性表征

采用改良的镉-茚三酮法对CPA与ZIF-8/CPA的酶活性能进行测定.通过特异性的降解Z-Phe-Leu释放出L-亮氨酸，测定L-亮氨酸的生成量表征CPA的降解活性，结果如图3，紫外光谱扫描结果显示在507 nm处出峰，并且ZIF-8/CPA复合物的峰比游离CPA的峰更高些，即ZIF-8/CPA复合物的吸光值更大，表明所制备的ZIF-8/CPA复合物成功保留了CPA的酶活性能，具有水解酰胺键的功能，在同等酶量条件下降解能力比游离CPA更强.

图3 游离CPA与ZIF-8/CPA复合物降解能力的测定Fig.3 Degradation ability of free CPA and ZIF-8/CPA

2.2 复杂体系下酶活性能的研究

2.2.1 不同温度下的酶活性能

比较15、25、35、45、55和65 ℃体系温度下相同CPA含量(15.2 μg)时游离CPA和ZIF-8/CPA复合物溶液的酶活性能，分别测定L-亮氨酸的生成量.检测结果如图4(a)，随着温度升高，游离CPA和ZIF-8/CPA复合物降解能力逐渐上升，其中游离CPA在25 ℃时达到最高值，随后下降，45 ℃略有恢复然后迅速下降；ZIF-8/CPA降解能力在35 ℃达到峰值，随后逐渐下降直到45 ℃，最后保持稳定.整个实验过程中，ZIF-8/CPA复合物不仅最高降解能力高于游离CPA，且大部分温度点降解能力优于游离CPA，表明ZIF-8材料的负载可以在不同温度下有效地保护CPA的降解能力，同时起到一定的提高能力.这可能是由于ZIF-8材料可以阻碍传热从而减少CPA三维结构的破坏.

2.2.2 不同pH值下的酶活性能

比较pH值在2.6、4.5、6.0、7.5、9.0的体系中相同CPA含量(15.2 μg)的游离CPA和ZIF-8/CPA复合物溶液的酶活性能.实验结果如图4(b)，当体系pH值低于4.5时，ZIF-8/CPA复合物与游离CPA的活性都比较低，其中ZIF-8/CPA复合物活性略高于游离CPA.当pH值逐渐增大时，两者活性都迅速上升，在pH 7.5左右达到峰值，此时游离酶活性仅为ZIF-8/CPA复合物活性的61.57%.随后两者活性均缓慢下降.结果表明ZIF-8材料可以保护CPA在不同pH值条件下的降解能力，同时提高CPA的降解能力.

2.2.3 不同有机试剂(乙醇)含量下的酶活性能

比较不同乙醇含量(0、15%、20%、30%、40%、50%)的体系中相同CPA含量(15.2 μg)的游离CPA和ZIF-8/CPA复合物的酶活性能，检测结果如图4(c).当体系中存在乙醇的情况下，ZIF-8/CPA复合物和游离CPA的活性都发生降低.乙醇含量较低时，ZIF-8/CPA复合物活性下降较明显，当乙醇含量超过15%时，下降的幅度减缓.游离CPA的活性随着乙醇含量的增加而持续降低，下降趋势也逐渐增大.当乙醇含量达到50%时，游离CPA活性降低90.75%，ZIF-8/CPA复合物活性降低50.29%，结果表明ZIF材料可以对CPA进行有效地保护，防止乙醇等有机试剂接触CPA，从而破坏其空间结构，影响酶活性能.

2.2.4 不同储存天数下的酶活性能

将游离CPA 与ZIF-8/CPA复合物在4 ℃的0.1 M磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.5)储存，在2、7、14、30、65 d后分别取出进行检测，检测结果如图4(d).随着保存时间的延长，ZIF-8/CPA复合物的酶活性能呈线性下降趋势，在保存65 d后，ZIF-8/CPA复合物的酶活性能降低59.85%.而游离CPA在前14 d酶活性能迅速下降为原始酶活性能的35.98%，随后下降趋势变缓，在第65 d时降低为原始酶活性能的3.78%.实验结果表明ZIF材料负载可以延长CPA的有效保存时间，ZIF-8材料通过多孔结构避免CPA与外界不良环境接触，防止结构与CPA活性遭到破坏.

2.2.5 不同循环使用次数下的酶活性能

对同一批次孵育反应的ZIF-8/CPA复合物和游离CPA进行多次重复孵育，分别检测酶活性能，检测结果如图4(e).在前4次循环中，ZIF-8/CPA复合物和游离CPA的酶活性能变化不大，其中ZIF-8/CPA复合物的酶活性为游离CPA的1.5倍左右.随后游离CPA的酶活性能开始线性下降，第10次循环使用时下降53.56%.ZIF-8/CPA复合物的酶活性能在第七次循环时开始缓慢下降，第10次循环时仅下降13.87%.游离CPA活性的降低一方面由于难以收集，一方面由于没有保护，在降解过程中结构受到破坏.实验结果表明ZIF材料不仅可以有效保护CPA的酶活性能，还有利于进行重复收集，从而实现循环使用.

图4 不同优化条件下CPA和ZIF-8/CPA降解能力对比Fig.4 Degradation ability of free CPA and ZIF-8/CPA in different conditions

2.2.6 最佳条件下对CPA 与ZIF-8/CPA的酶活性能

由单因素实验结果可知，体系温度和pH值对酶活影响最大，因此对两者综合影响进一步分析(pH范围为6～9，温度设置在25 ℃～45 ℃范围)，实验结果如图5.游离CPA在pH值接近7.5，反应温度接近25 ℃时生成的L-亮氨酸含量趋于最高值，而ZIF-8/CPA复合物在pH值接近7.5，反应温度接近35 ℃时生成的L-亮氨酸含量趋于最高值.响应面分析结果与单因素结果相接近.

图5 温度和pH对生成亮氨酸含量的影响Fig.5 Interaction of temperature and pH value for Leucine content

为充分体现ZIF-8/CPA复合物在酶活性能上的优势，选择在游离CPA的最佳孵育条件进行孵育比较，即pH 7.5，体系温度25 ℃.实验结果如图4(f)所示.降解初始，底物浓度较高，ZIF-8/CPA复合物和游离CPA的酶活均为最高值，此时ZIF-8/CPA复合物酶活性能远高于游离CPA，游离CPA的酶活仅为ZIF-8/CPA复合物的18.67%.随着降解的进行，ZIF-8/CPA复合物体系中底物浓度迅速下降，导致酶活性能也迅速下降，在7 min左右达到稳定值.游离CPA的酶活性能在整个降解期间基本保持稳定，可能是由于降解能力较低导致体系底物浓度变化不大.降解结束后，酶活性能达到稳定值，此时游离CPA酶活性能为ZIF-8/CPA复合物的56.13%.实验结果表明，即使在游离CPA的最佳孵育条件下，其酶活性能也远低于ZIF-8/CPA复合物，即ZIF-8材料的负载，不仅可以有效的保护游离CPA的酶活性能，使其在偏离最佳降解条件下仍具有相当良好的酶活性能，并满足较长的保存时间和多次重复利用，同时对CPA酶活性能具有提升效果.

2.3 实际样品中OTA降解能力的研究

西瓜汁与梨汁样品初始pH值均低于7.5，OTA添加量为250 ng/mL.样品按空白对照组、游离CPA、ZIF-8/CPA、游离CPA与ZIF-8材料混合物、纯ZIF-8材料5组，分别进行OTA降解实验，检测结果如表1、2.

表1 赭曲霉毒素A的ELISA试剂盒检测不同对照组对西瓜汁中OTA的降解率(n=3)Table 1 Degradation rates analysis of OTA in watermelon juice in different groups with ELISA Kit(n=3)

表2 赭曲霉毒素A的ELISA试剂盒检测不同对照组对梨汁中OTA的降解率(n=3)Table 2 Degradation rates analysis of OTA in pear juice in different groups with ELISA Kit(n=3)

对照组OTA含量保持稳定，证明其自身稳定不易分解.ZIF-8组OTA含量轻微下降，可能是其多孔材料自身具有一定的吸附性，对OTA进行了轻微吸附.游离CPA组中OTA被逐渐降解，当降解时间在10～45 min内降解率随降解时间延长而增大，当降解45 min以后，降解率逐渐趋于稳定，不再升高.因此，当降解时间为45 min时降解效果最佳.45 min时西瓜汁和梨汁中降解率分别达到45.29%和18.05%，可能是由于体系pH值差异引起酶活性能的差异.游离CPA与ZIF-8机械混合组中OTA减少率高于纯CPA组，可能是由于降解与吸附作用同时产生所导致.而制备ZIF-8/CPA复合物对样品中OTA降解效果最佳，45 min时对OTA降解率分别达到94.49%和67.11%，远高于其他组别，随后降解率保持稳定.实验结果表明ZIF-8材料对CPA进行负载可以有效保护游离CPA的降解活性，并提高降解能力，具有一定的实用价值.实验中所有检测重复3次，分别根据梨汁西瓜汁降解率数据计算出各自的P值均大于0.05的，显著性差异不明显，表明检测结果的稳定性和重复性较好.

3 结论

实验通过使用ZIF-8材料对游离CPA进行有效负载，在保护游离酶生物活性的同时对酶活性能进一步进行了提升.负载过程中，ZIF-8材料与酶的重量比为13 ∶2，负载产物ZIF-8/CPA复合物对于复杂体系条件，包括温度、pH值、有机试剂含量等具有良好的适应能力，同时具备更久的保藏时间与更强的可重复使用能力.在游离CPA的最佳孵育条件下，ZIF-8/CPA复合物酶活性为游离CPA的5倍以上，在实际样品中对OTA的降解的能力也高于游离CPA的2倍以上.因此，使用金属有机骨架化合物对真菌毒素降解酶进行负载保护，在真菌毒素降解上具有一定的应用前景，其应用范围与安全性还需要进一步的探索.