侧向流免疫层析-表面增强拉曼光谱联用技术超灵敏检测猪肉中喹乙醇残留

史巧巧，张惠琴，王 耀，孔德昭

(1．江苏科技大学 粮食学院，镇江 212100)(2．河南科技大学 食品与生物工程学院，洛阳 471023)

喹乙醇是1965年由德国人合成的一种抗菌促生长剂，是喹噁啉类广谱抗菌药物，具有蛋白同化作用，可提高饲料转化率与瘦肉率，促进动物生长[1].为此，喹乙醇在全世界得到迅速推广.随着被媒体曝光，“喹乙醇”这个名词一下子火了，一度被称为“新型瘦肉精”.众所周知，“瘦肉精”是臭名昭著的饲料违法添加物，曾经是深受养殖者喜爱的“养猪神器”，但瘦肉精对人体健康会产生不利作用，在我国早已明确禁用.与“瘦肉精”不同，喹乙醇是我国允许使用的兽药，因此，一些不法分子受到经济利益驱使，不顾国家对喹乙醇的使用规定限制，而大剂量的将其应用于动物养殖.目前，有研究表明[2-3]，大剂量喹乙醇对动物可产生毒性作用，并且，喹乙醇在体内具有蓄积性，在动物体内蓄积到一定程度时会对动物或人产生致畸、致癌、致突变的“三致作用”.欧洲和美国已禁止喹乙醇作为饲料添加剂使用，我国《中华人民共和国兽药典》中规定，喹乙醇作为抗菌促生长剂，仅限用于体重在35 kg以下的猪的促生长，且国家进出口检验检疫局规定猪肉中不得检出喹乙醇残留.因此，研究和开发对喹乙醇等新型瘦肉精的痕量快速检测技术是极为必要的.

目前，针对喹乙醇类违禁添加药物的检测技术主要包括色谱法、光谱法以及免疫分析法等[4-8].色谱法虽属于国际上公认的食品安全检测确证方法，但其成本较高且操作繁琐，只有专业人员才可进行检测，难以实现现场检测及基层推广.相对来说，借助于抗原、抗体之间的高特异性反应的免疫分析法更占优势，其中免疫层析试纸具备简便、易于操作，成本低等优点，基本实现人人可操作，已被普遍应用到企业、检测机构、甚至消费者的家中，但是胶体金试纸只能实现定性或者半定量的检测，其灵敏度急需提高[9-10].

由于表面增强拉曼光谱(SERS)技术可检测低至单分子水平的目标物，是目前最灵敏的分析方法之一[11-12]，而贵金属纳米材料胶体金具有良好的SERS增强效应，且已经被普遍应用于试纸检测，因此，本研究拟通过以胶体金为纽带将侧向流免疫层析与SERS技术进行有机结合，建立新型的SERS-LFA法，不仅具有SERS的高灵敏性和光谱可区分性，还具有免疫分析的高特异性和便捷性.

1 实验材料

1.1 试剂

新鲜瘦猪肉购自苏州当地某超市；氯金酸(HAuCl4·4H2O)、柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7·2H2O)，上海国药控股股份有限公司；4-氨基苯硫酚(PATP)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羊抗小鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)，北京索莱宝科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维棉、吸水纸、支撑底板，德国Millipore公司.免疫抗原(OLA-BSA)、包被抗原(OLA-OVA)和喹乙醇单克隆抗体(OLA mAb)均在河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备并保存.整个实验过程均使用超纯水(DDW)，由Milipore公司的Mili-Q Integral system仪器制备.

1.2 仪器

UV2600紫外可见分光光度计，日本Shimadzu公司；Multiskan FC型酶标仪，美国Thermo公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN透射电镜，美国FEI公司；JSM-6390扫描电子显微镜，日本电子JEOL；XYZ-3000型喷金-点膜仪，美国Bio-Dot公司；TSR-3000型读条仪，美国Bio-Dot公司；CM 4000 型切割机，美国Bio-Dot公司；HGS802型压壳机，杭州峰航科技公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；低温高速离心机，美国Sigma公司；LABRAM HR激光共聚焦拉曼光谱仪，日本Horiba公司.

2 实验方法

2.1 拉曼标记免疫探针的制备

采用Frens[13]的方法制备胶体金，取98.8 mL的DDW和1.2 mL 的1% 氯金酸溶液先后置于250 mL的三口圆底烧瓶中，油浴条件下加热回流，并伴以大力搅拌，待溶液沸腾后，迅速加入0.7 mL的1% 柠檬酸三钠水溶液.继续加热搅拌，使溶液保持沸腾状态15 min，此过程中溶液颜色由最初的浅黄色，最后变为酒红色，之后稳定不变色，反应结束后自然冷却至室温待用.通过紫外-可见分光光度计、动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)对制备的AuNPs的粒径和形貌进行鉴定.

探针制备过程如图1.参考文献[14]的方法并稍加修改，取10 mL AuNPs溶液，加入0.2 mol/L K2CO3溶液调整pH至8.0左右，再加入适量的1 mmol/L的PATP乙醇溶液，4℃低温搅拌过夜，然后10 000 r/min离心10 min，弃去上清液，将沉淀物用适量的DDW重悬，再经多次离心、洗涤、重悬，即得AuNPs-PATP溶液.向1.0 mL该溶液中加入OLA mAb，搅拌30 min后放入4℃冰箱反应过夜,再加入100 μL 10%的BSA溶液，反应3 h.最后，将溶液以12 000 r/min的速度在4 ℃下离心30 min，保留离心管底部的沉淀，用300 μL TB缓冲液重悬，于4 ℃保存待用.

图1 探针制备示意Fig.1 Schematic illustration showing preparation of immunoprobe

2.2 SERS-LFA试纸的组装

将 NC 膜置于 XYZ-3000 三维喷膜仪平台上，取适量的 OLA-OVA 溶液放于贮存池A，GaMIgG-HRP 溶液放于贮存池 B，按照 0.9 μL/cm的参数进行喷膜操作，分别将 OLA-OVA和 GaMIgG-HRP点射于 NC 膜上的指定位置，从而形成间距大约为 4 mm 的检测线(T 线)和质控线(C 线).将印制好的 NC 膜置于 45 ℃鼓风干燥箱中干燥 4 h，取出并粘贴在底板中间位置，如图2，按上述顺序组装试纸，每部分的相连处需要重叠2～3 mm并压紧，然后放入 CM4000 切割机槽内切割成指定宽度，再根据需要安装卡壳，之后将试纸装入密封袋，并放入干燥剂，室温保存待用[15].

图2 拉曼试纸的组装示意Fig.2 Assembly of the SRES-LFA strip

2.3 SERS-LFA检测方法的建立

在试纸结合垫的位置处滴加1.0 μL 的OLA mAb-AuNPs-PATP拉曼免疫探针，之后取100 μL OLA的标准溶液或样品溶液滴在样品垫的位置，喹乙醇标准溶液或样品溶液会连同拉曼免疫探针OLA mAb-AuNPs-PATP一起借助于毛细管的作用沿着吸水纸的方向流动，在流动过程中，NC膜上面的T线和C线就会进行显色，整个免疫层析分析过程在10 min内完成，NC膜上面T线所捕获的拉曼免疫探针OLA mAb-AuNPs-PATP可以通过激光共聚焦拉曼光谱仪进行检测，该拉曼光谱仪的激发波长为632.8 nm，激光功率为10 mW，积分时间为10 s，每次测量时沿T线中央位置均匀的采集10个点，测量后计算他们的平均值，以此来确保实验数据的真实性和合理性.

2.4 猪肉样品的处理和检测

猪肉样品经LC-MS验证为阴性样品，取1.00±0.05 g绞碎猪肉加入2.0 mL 生理盐水，充分振荡均匀，13 000 r/min离心5 min，除去沉淀，取上清液分别添加喹乙醇标准品至终浓度为0、0.000 1、0.001、0.01、0.1、1.0 ng/mL，检测时分别取100 μL样品液用于SERS-LFA试纸测试，且每次测定需重复3次.

3 结果和分析

3.1 材料的表征

AuNPs的尺寸大小对拉曼信号的强度和拉曼免疫探针的稳定性影响颇大.选用54 nm的AuNPs，因为它既适用于试纸条的制备，同时也具有较强的拉曼信号[16].采用TEM和DLS分别对AuNPs的形貌和尺寸进行表征，如图3、4.结果表明，所制备的AuNPs多呈圆形或椭圆形、分散均匀、尺寸约为54 nm.在波长400～800 nm下进行紫外可见光谱扫描，结果显示，AuNPs 和AuNPs-PATP的最大吸收波长均在536 nm左右，相比较，OLA mAb-AuNPs-PATP的最大吸收波长发生了红移，位置在541 nm，因此，说明了OLA mAb已经成功地吸附在了AuNPs-PATP表面(图5).此外，相对于单纯的AuNPs，AuNPs-PATP和OLA mAb-AuNPs-PATP的拉曼光谱在1 078 cm-1和1 588 cm-1处显示出2个很强的PATP的特征峰(图6)，因此可以利用这2个特征峰进行拉曼免疫检测.

图3 AuNPs的TEM图Fig.3 TEM image of AuNPs

图4 AuNPs的DLS图Fig.4 DLS of AuNPs

图5 AuNPs、AuNPs-PATP 和拉曼免疫探针的紫外光谱图Fig.5 UV-vis spectra of AuNPs、AuNPs-PATP and immunoprobe

图6 AuNPs和拉曼免疫探针的拉曼光谱图Fig.6 Raman spectra of AuNPs and immunoprobe

3.2 试验参数的优化

制备拉曼免疫探针的抗体的添加量、包被抗原的浓度以及在试纸上使用的拉曼免疫探针的使用量对于确定 SERS-LFA 的检测灵敏度至关重要.采用抑制率(B0/B0.1)的大小进行评价，B0和B0.1分别指的是当分析物浓度分别为0和0.1 ng/mL时在试纸条检测线上测得的拉曼光谱在1 078 cm-1峰处的峰值.抑制比值越大，说明该检测的灵敏度越高.

图7(a)显示，随着抗体量的增加，B0/B0.1在增加，添加量为6 μL时B0/B0.1达到最大，继续增加B0/B0.1反而降低，这是因为当抗体浓度过大时，探针制备完成的离心浓缩过程中，会有少量的抗体的残留，从而影响后续的分析，导致B0/B0.1下降.因此，OLA mAb的最佳用量是6 μL.图7(b)中，探针的量是固定的，随着OLA-OVA量的增加，其与探针的结合逐渐达到饱和，再继续增加，B0/B0.1降低，因此，OLA-OVA的最合适浓度为0.1 mg/mL.最后，如图7(c)，在用量为1.5 μL时B0/B0.1最大，认为1.5 μL是应用于SERS-LFA的最佳用量.

图7 uNPs和拉曼免疫探针的拉曼光谱图Fig.7 Optimization of experimental conditions

3.3 灵敏度的测定

基于上述最佳条件，建立间接竞争型SERS-LFA检测喹乙醇的标准曲线：分别取0、10-4、10-3、10-2、0.1、1、10、100 ng/mL的喹乙醇标准溶液，层析结束后，用激光拉曼光谱仪收集T线的拉曼信号，如图8(a)、(b).随着分析物浓度的增大，所获得的拉曼峰强度逐渐降低，取急速下降的 0.000 1～1 ng/mL 区间段，取平均值为有效值，以喹乙醇的浓度对数值为横坐标，以1 078 cm-1位移处的拉曼强度值为纵坐标，绘制出标准曲线，如图8(c).在0.000 1～1.0 ng/mL 浓度范围内均呈现良好的线性关系，根据获得的拟合方程，计算得出SERS-LFA法对喹乙醇的检测灵敏度(IC50)为0.025 ng/mL，最低检测限(LOD)为0.31 pg/mL.

图8 喹乙醇检测标准曲线的建立Fig.8 Establishment of standard curve for detection of olaquindox

3.4 猪肉样品的添加回收

将不同浓度的喹乙醇标准溶液添加到猪肉样品中，进行样品前处理，之后将所得溶液应用于SERS-LFA，层析结束后，用拉曼光谱仪对T线的拉曼信号强度进行测定.结果见表1，研究发现喹乙醇的加标回收率在93%～108%范围之间，RSD在3.7%～6.1%范围内，说明该SERS-LFA能够有效的检测出猪肉样品中的目标分析物.

表1 SERS-LFA试纸对喹乙醇的加标回收实验Table 1 Recovery of the OLA from spiked samples measured by SERS-LFA strip

3.5 重现性的测定

为了考察方法的稳定性，选取5个浓度梯度的喹乙醇标准溶液，试纸层析结束后晾干，沿着每个试剂条的检测线中间位置分别随机测定10个点的拉曼光谱，取1 078 cm-1处的拉曼强度，结果如图9，可以看出随着喹乙醇浓度的升高，拉曼强度逐渐降低，在相同浓度的试纸条中，随机测定10个点的相对标准偏差(RSD)值分别为5.6%，6.3%，3.7%，4.8%和3.1%，说明该方法对于SERS信号检测的精密度较高.

图9 不同浓度试纸条沿着T线随机采集10个点测定在1 078 cm-1处的SERS强度Fig.9 SERS intensity of PATP at 1078 cm-1 from 10 different spots along the test lines on the strips when the OLA concentrations were at 0,0.001,0.01,0.1 and 1.0 ng/mL,respectively

4 结论

文中成功构建了一种简便、快捷、超灵敏的SERS-LFA方法来检测猪肉中的喹乙醇残留.结果证明SERS-LFA 具有较高的灵敏度、较低的检测限，与传统的LFA相比，检测限降低了将近10 000倍.且具有良好的准确性、重复性，并且该法不仅限于喹乙醇的检测，凡具有两种不同类型的抗体或适配体的其他有害组分，该方法均有望适用，为未来临床、生物、食品和环境样品中物质的定量分析提供了一种新方法.