猪德尔塔冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

钱炳旭，白雪雁，张成成，郭梦娇，李梦娇，廖 凯，薛 峰，吴艳涛，张小荣*

(1.扬州大学 兽医学院 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225000；2.南京农业大学 动物健康与食品安全国际合作实验室，江苏 南京 210095)

猪德尔塔冠状病毒(porcine Deltacoronavirus，PDCoV)是2012年首次在中国香港发现的肠道致病性冠状病毒[1]，可感染各个年龄段的猪，对新生仔猪有较强的致病性，表现为水样腹泻、呕吐，严重时会因脱水致死，发病率和病死率较高[2-5]。2014年，美国首次出现PDCoV的大规模流行，俄亥俄州、爱荷华州、伊利诺斯州等多地相继暴发了仔猪腹泻，研究人员在发生腹泻的猪场检测到PDCoV，并采集病料进行了病毒分离[6-7]。随后，PDCoV在泰国[8]、加拿大[9]、韩国[10]、中国[11]等地均有出现和报道，呈现全球流行的趋势，逐渐成为威胁世界养猪业的重要腹泻病原之一。

PDCoV属于冠状病毒科、德尔塔(δ)冠状病毒属，是有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈多形性，内部基因组RNA和核衣壳蛋白组成了核蛋白核芯。病毒外膜上有大量棒状结构突起，直径为60～180 nm，呈典型的“皇冠”状冠状病毒形态[12]。PDCoV的基因组约为25.4 kb，是目前已知的冠状病毒中基因组最小的，GC含量约为43%。基因组组成、排列顺序为：5′非翻译区(untranslated region，UTR)、开放阅读框(open reading frame，ORF)1a/1b、棘突蛋白(spike，S)、小膜蛋白(envelope，E)、膜蛋白(membrane，M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)、辅助蛋白NS6、辅助蛋白NS7以及3′端非翻译区[13]。

PDCoV感染后的病理变化与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)十分相似，主要表现为肠壁变薄、透明(远端空肠至结肠)，肠腔内有大量淡黄色的液体；组织病理切片可观察到浅层绒毛上皮肿胀和空泡化；胃中有未消化的凝乳，严重者可观察到胸腔腹腔积液，小肠壁及肠系膜充血、出血[12,14]。所以猪场一旦出现猪腹泻，在临床上难以鉴别诊断，确诊病原需依赖实验室检测。PAN等[15]根据PDCoV的ORF1b基因设计了特异性的引物和探针，建立了一种实时荧光定量PCR方法，检测限可达1×102拷贝/L。LUO等[16]和LU等[17]分别以M和S蛋白为靶蛋白，建立了快速、简便的检测血清和乳汁中抗体的间接ELISA方法，可用于PDCoV的临床诊断和疫苗免疫评价。N蛋白是冠状病毒粒子中数量最多的结构蛋白，高度保守[18]，因此本试验选择N蛋白作为靶蛋白，建立了用于PDCoV特异性抗体检测的间接ELISA方法，从而为PDCoV感染的快速诊断和流行病学监测提供快速、准确、有效的高通量检测手段。

1 材料与方法

1.1 载体与菌株表达载体pET-32a，购自Novagen公司；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 血清PDCoV、PEDV、TGEV、猪轮状病毒(porcine rotavirus，PRoV)等抗血清均由扬州大学兽医学院传染病重点实验室制备和保存。

1.3 主要试剂T4DNA连接酶、TMB substrate kit和限制性内切酶均购自Thermo Fisher公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG和羊抗鼠IgG购自Sigma公司；小量提取质粒试剂盒与胶回收试剂盒均购自Axygen公司；His标签蛋白的单克隆抗体和Ni-NTA亲和层析介质均购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.4 PDCoV N蛋白的原核表达及纯化

1.4.1PDCoV N蛋白原核表达质粒的构建 通过DNAStar软件包中的Protean程序，对PDCoV CHN/Tianjin/2016株N蛋白氨基酸序列(GenBank登录号：KY065120)进行分析，挑选其中抗原性较好的一段(265～342 aa)，根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性规律，对其基因片段进行密码子优化设计，为方便克隆，基因片段两端分别加上BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶识别位点，优化的基因片段N-Opti委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ将人工合成的N基因片段定向克隆入原核表达载体pET-32a相应位点之间，获得重组质粒pET-32a-PDCoV-N-Opti(图1)。

图1 pET-32a-PDCoV-N-Opti重组质粒图谱

1.4.2PDCoV N蛋白的诱导表达与鉴定 将重组质粒pET-32a-PDCoV-N-Opti转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，获得重组表达菌BL21(DE3)/pET-32a-PDCoV-N-Opti。将重组菌1∶100接种于含有氨苄青霉素(100 g/mL)的LB液体培养基中，培养至菌液D600 nm值在0.4～0.6之间，加入终浓度0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达，同时设立BL21(DE3)/pET-32a的阴性菌对照，进行SDS-PAGE和Western blot试验以分析PDCoV-N-His蛋白的表达情况。

1.4.3PDCoV N蛋白的纯化 利用Ni-NTA亲和层析介质纯化PDCoV-N-His蛋白，参照说明书配制试剂，使用含250 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白，完成后收集蛋白滤液、洗涤液、洗脱液，进行SDS-PAGE，观察蛋白条带，分析纯化效果。

1.5 检测PDCoV抗体的间接ELISA方法的建立

1.5.1抗原最佳包被质量浓度和一抗最佳稀释度的确定 棋盘滴定法确定抗原最佳包被浓度和一抗血清最佳稀释度。PDCoV-N-His蛋白用碳酸盐包被液按8.0,4.0,2.0,1.0,0.5 mg/L质量浓度梯度进行稀释，PDCoV阳性血清和猪阴性血清用PBST稀释1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400的梯度，进行间接ELISA检测，比较P/N值，选择P/N最大值对应孔的抗原包被浓度和一抗血清稀释度作为最佳工作浓度。

1.5.2最佳封闭条件的确定 分别以1% BSA、5%脱脂乳、5%马血清、5%小牛血清作为封闭液，每种封闭液设立30，60，90，120 min的孵育时间梯度，PDCoV阳性血清和猪阴性血清作为一抗，每份血清各做3个重复，进行间接ELISA检测，比较各组阴阳性血清的P/N值，选择P/N值最大的封闭液和封闭时间作为最佳封闭条件。

1.5.3最佳一抗和底物孵育时间的确定 一抗孵育时间设立30，60，90，120 min的时间梯度，底物显色时间设立10，15，20，25 min的时间梯度，PDCoV阳性血清和猪阴性血清作为一抗，每份血清各做3个重复，进行间接ELISA检测，比较各组阴阳性血清的P/N值，分别选择P/N值最大的孵育时间为最佳条件。

1.5.4酶标二抗最佳孵育条件的确定 根据已确定的最佳条件，兔抗猪IgG-HRP按照1∶2 500,1∶5 000,1∶7 500,1∶10 000的梯度进行稀释，每个稀释度再设30，60，90，120 min的孵育时间梯度，PDCoV阳性血清和猪阴性血清作为一抗，每份血清各做3个重复，进行间接ELISA检测，比较各组阴阳性血清的P/N值，选择P/N值最大的二抗稀释度和孵育时间为最佳条件。

1.5.6特异性试验 利用本研究建立的间接ELISA方法检测PEDV、TGEV、PRoV阳性血清，同时设立PDCoV阳性血清和猪阴性血清的对照，验证ELISA方法的特异性。

1.5.8间接ELISA方法的初步应用 应用本研究所建立的检测PDCoV抗体的间接 ELISA 方法，对本实验室保存的20份PDCoV猪阳性血清样品和20份猪阴性血清进行检测，以验证间接ELISA方法的检测结果是否可靠。

2 结果

2.1 PDCoV N蛋白的原核表达

2.1.1原核表达质粒的酶切鉴定 利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ对重组质粒进行酶切鉴定，结果如图2，可见重组质粒的酶切产物可产生5.4 kb 大小的载体条带和234 bp大小的目的条带，空载体pET-32a则仅观察到1条5.4 kb的载体条带。

M.100 bp DNA Marker；1.pET-32a-PDCoV-N-Opti；2.pET-32a

2.1.2PDCoV N蛋白的SDS-PAGE鉴定 如图3所示，重组菌BL21(DE3)/pET-32a-PDCoV-N-Opti的表达产物蛋白相对分子质量约为31 kDa，与PDCoV-N-His重组蛋白的相对分子质量大小一致，并且表达产物主要存在于上清中，表明重组N蛋白呈可溶性表达。

M.蛋白Marker；1.重组菌/上清；2.重组菌/沉淀；3.阴性对照/上清；4：阴性对照/沉淀

2.1.3Western blot分析 取1.4制备的蛋白样，以His蛋白的单抗(1∶1 000稀释)为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)为二抗，稀释液均为5%脱脂乳，进行Western blot分析。结果如图4所示，可见重组菌裂解产物在31 kDa处有特异性蛋白条带，而阴性菌的裂解产物仅在20 kDa处有特异性条带，与His标签蛋白分子量大小相符，说明重组蛋白PDCoV-N-His在表达过程中，融合了载体上的His标签蛋白成功表达。

M.蛋白Marker；1.重组菌/上清；2.重组菌/沉淀；3.阴性对照/上清；4.阴性对照/沉淀

2.1.4PDCoV N蛋白的纯化 使用Ni-NTA亲和层析介质纯化PDCoV-N-His蛋白，SDS-PAGE分析蛋白纯化效果。PDCoV-N-His蛋白纯化后的洗脱液在31 kDa有较为单一的蛋白条带(图5)，与预期相符，纯化效果较好，蛋白质量浓度为2.2 g/L。将纯化后的重组蛋白透析到PBS(pH7.4)中，-20℃ 保存备用。

M.蛋白Marker；1.PDCoV-N-His蛋白；2.PDCoV-N-His蛋白滤液；3,4.洗涤液；5.洗脱液

2.2 PDCoV抗体的间接ELISA检测方法的建立

2.2.1抗原最佳包被质量浓度和血清最佳稀释度的确定 采用棋盘滴定法，确定最佳抗原包被质量浓度和血清稀释倍数。PDCoV-N-His重组蛋白质量浓度8.000～0.125 mg/L倍比稀释，PDCoV阳性血清和猪阴性血清进行1∶25,1∶50,1∶100,1∶200,1∶400,1∶800倍稀释，每个血清设3个重复，进行间接ELISA检测，读取D450 nm值。结果如图6所示，最佳抗原包被质量浓度为1 mg/L，最佳血清稀释倍数为1∶100。

图6 抗原包被浓度及血清稀释倍数的确定

2.2.2最佳封闭条件的确定 分别以1% BSA、5%脱脂乳、5%马血清、5%类胎牛血清作为封闭液，每个封闭液孵育时间设立30，60，90，120 min的梯度，PDCoV阳性血清和猪阴性血清作为一抗，每份血清各做3个重复，进行间接ELISA检测，读取D450 nm值。结果如图7所示，最佳封闭液为1% BSA，最佳封闭时间为60 min。

图7 封闭液和封闭时间的确定

2.2.3最佳一抗孵育时间和底物显色时间的确定 一抗孵育时间设立30，60，90，120 min的梯度，底物显色时间设立10，15，20，25 min的时间梯度，PDCoV阳性血清和猪阴性血清作为一抗，每份血清各做3个重复，进行间接ELISA检测，读取D450 nm值。结果如图8所示，一抗的最佳孵育时间为60 min。

图8 一抗孵育时间和底物显色时间的确定

2.2.4酶标二抗最佳孵育条件的确定 PDCoV阳性血清和猪阴性血清作为一抗，每份血清各做3个重复，兔抗猪IgG-HRP设立1∶2 500,1∶5 000,1∶7 500,1∶10 000的稀释梯度，每个稀释度的孵育时间设立30，60，90，120 min的梯度，进行间接ELISA检测，读取D450 nm值。结果如图9所示，兔抗猪IgG-HRP的最佳稀释度为1∶5 000，最佳孵育时间为60 min。

图9 兔抗猪IgG-HRP稀释度和孵育时间的确定

2.2.6特异性试验 使用建立的间接ELISA方法检测PEDV、TGEV、PRoV血清，同时设立PDCoV 血清和猪阴性血清对照，每份样品均设立3个重复，读取D450 nm值。结果如图10所示，PEDV、TGEV、PRoV血清和猪阴性血清的D450 nm值均小于临界值0.3，判定为阴性；PDCoV阳性血清的D450 nm值大于临界值0.3，判定为阳性。结果表明建立的间接ELISA方法可与PDCoV抗体特异性反应，具有良好的特异性。

图10 间接ELISA方法的特异性试验结果

2.2.7重复性与稳定性试验 使用建立的间接ELISA方法检测8份PDCoV阳性血清样品，每个样品重复4次，读取D450 nm值。经统计学分析，结果如表1所示，方法的批内变异系数为2.0%～3.5%，批间变异系数为5.8%～9.7%，变异范围均小于10%，表明本研究建立的间接ELISA检测方法具有较好的重复性和稳定性。

表1 批内和批间重复性试验变异情况

2.2.8间接ELISA方法的初步应用 应用本研究建立的检测PDCoV抗体的间接ELISA方法，对本实验室保存的20份PDCoV阳性血清(1～20)和20份猪阴性血清(21～40)进行检测，读取D450 nm值。结果如表2所示，20份阳性血清检测结果均为阳性，阳性符合率为100%(20/20)；20份阴性血清检测结果均为阴性，阴性符合率为100%(20/20)，表明间接ELISA方法的检测结果准确、可靠，具有临床应用价值。

表2 间接ELISA方法对40份血清的检测结果

3 讨论

PDCoV是一种新发现的肠道致病性冠状病毒，主要引起新生仔猪腹泻，发病率和病死率较高。PDCoV在我国各地广泛流行，如四川、黑龙江、天津、河南等地均有该病毒的相关报道。有研究显示[19]，目前PDCoV感染已成为导致我国新生仔猪死亡的重要原因之一。PDCoV感染仔猪的临床症状与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)非常相似，临床上难以鉴别诊断。因此，本研究的目的是建立用于PDCoV特异性抗体检测的间接ELISA方法，从而为PDCoV感染的快速诊断和流行病学监测提供快速、准确、有效的检测手段。

PDCoV N蛋白是具有高度保守性和种属特异性的结构蛋白，且在PDCoV感染细胞过程中产生量最大，病毒感染宿主后最早可检出的抗体也是针对N蛋白的特异性抗体[20]，因此，以N蛋白作为目标蛋白建立PDCoV感染相关检测技术具有重要意义。SU等[21]通过大肠杆菌原核表达系统，制备了PDCoV N重组蛋白，表达的N蛋白能特异性结合PDCoV抗血清，具有良好的特异性，然而该研究中表达的N蛋白基本以包涵体形式存在。通常情况下以包涵体形式表达的重组蛋白在纯化环节操作较为复杂，耗费时间较长，且在蛋白变性和复性的过程中容易失败，更为重要的是包涵体蛋白的免疫原性比可溶性蛋白差，应用价值相对较低。为了使原核表达的PDCoV N蛋白具有可溶性且保持更好的免疫原性，本研究依据生物信息学分析和大肠杆菌密码子使用偏嗜性规律，设计、合成了N-Opti基因片段，并将其克隆入融合表达载体pET-32a多克隆位点中，构建表达质粒。表达载体pET-32a携带的His可溶性标签蛋白可以和PDCoV N蛋白进行融合，促进蛋白正确折叠，从而提高目的蛋白的可溶性，并且可以通过标签蛋白纯化PDCoV N重组蛋白，简化纯化的步骤。本研究经诱导表达和纯化，成功制备了高纯度、可溶性重组蛋白PDCoV-N-His，一系列生物学特性试验结果显示制备的重组蛋白具有良好的免疫原性和特异性，为后续PDCoV抗体间接ELISA检测方法的建立奠定了坚实的基础。

以可溶性的PDCoV N重组蛋白为包被抗原，并优化各步反应条件，建立了特异性检测PDCoV抗体的间接ELISA方法。为了验证其检测效果，使用该方法检测20份已知背景的PDCoV阳性血清和20份猪阴性血清，结果显示阳性符合率为100%(20/20)，阴性符合率为100%(20/20)，表明建立的检测PDCoV抗体的间接ELISA方法具有实际应用价值，为猪群中PDCoV感染的抗体水平监测、快速诊断和流行病学调查提供了一种血清学检测方法。

由于目前国内外尚未研制出预防PDCoV感染的疫苗，因此猪群只要检出PDCoV抗体阳性，就可以确诊为PDCoV感染。本研究建立的针对PDCoV抗体的间接ELISA检测方法适用于PDCoV感染流行病学调查中对于大批样品的筛查，也为猪群中PDCoV感染的快速诊断、流行病学调查和抗体水平监测提供了准确而有效的检测手段。