FACSAriaⅢ流式细胞仪分选小鼠肺脏自然杀伤细胞方法的建立与评价

户乃丽，徐晓雪，邹林樾，田 蜜

（首都医科大学中心实验室，北京 100069）

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是机体天然免疫系统的重要组成部分，与抗病毒免疫、移植免疫、自身免疫疾病及肿瘤免疫密切相关[1,2]。不同种属NK 细胞的特征性表面标记有所不同，人NK 细胞通常以CD56+CD3－表型来进行鉴定，而在小鼠中NK1.1、NKp46 和CD49b（DX5）等往往被用作鉴定NK 细胞的标志分子[3,4]。NK 细胞在体内含量较低，获取高纯度高活性的NK 细胞对于进一步研究具有重要意义。免疫磁珠分离是目前常用的纯化NK 细胞的方法之一，利用磁珠分选脾脏、血液等组织可得到纯度90%以上的NK 细胞。由于肺脏属于较韧的实质组织，含有大量的结缔组织，处理过程中需要胶原酶消化，过程中会产生一定的死细胞，磁珠分选后会有部分活性不佳的NK 细胞残留，影响分选后细胞活性。本实验拟利用密度梯度离心结合流式细胞4 色标记分选，加入识别细胞死活的染料，建立一种高速高效分离纯化小鼠肺脏NK 细胞的方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取5 只雄性C57BL/6 小鼠，SPF级，体质量28～30 g，5～6 周龄，购于首都医科大学实验动物部，饲养温度20 ℃～25 ℃，湿度40%～70%。单笼饲养，正常饮水进食。

1.2 试剂与仪器 RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自Gibco 公司；胶原酶V、台盼蓝试剂购自Sigma Aldrich公 司；FVS510、CD3-FITC、CD19-FITC、NKp46-PE、NK1.1-APC 抗体为Biolegend 公司产品；红细胞裂解液、流式细胞仪质控CST 微球、Accudrop beads 购自BD 公司；实验所用仪器为BDAriaⅢ型流式细胞分选仪，配有488 nm、561 nm、633 nm、405 nm 四只激光器。

1.3 方法

1.3.1 肺单细胞悬液的制备 小鼠处死，开胸取出肺组织，PBS 反复清洗，剪除气管支气管，将肺组织轻柔剪成1～2 mm 3 小块，将组织加入37 ℃的新原酶Ⅴ消化液中，置入37 ℃的水浴箱中，每隔5 min 轻轻振摇1 次，约60 min 时可见肺组织被全部消化；轻轻吹打分散细胞，收集消化液200 目不锈钢网过滤，离心去上清后加入PBS 重悬细胞再次离心去上清；加入红细胞裂解液5 ml，冰上孵育10 min，离心去上清；加入PBS 离心漂洗1～2 次，去上清，得到小鼠肺单细胞悬液。

1.3.2 流式细胞染色 取分离的细胞细胞，计数并用500 μl PBS 定容悬浮，根据说明书配比加入FVS510染料孵育1 h，PBS 洗涤2 次，Fc-R 阻断剂封闭后再依次加入CD3-FITC、CD19-FITC、NKp46-PE、NK1.1-APC 避光孵育1 h，PBS 洗涤2 次，调整体积为1 ml，待上机检测及分选。

1.3.3 分选液流参数和断点的调节 流式细胞仪鞘液桶和水桶用75%酒精浸泡消毒4 h 以上，用纯水冲洗干净，鞘液桶中加入无菌PBS，运行开机程序，安装85 μm 喷嘴，分选电压4500 V，Freq 设定为47.4，调节液滴振幅Ampl 值使液流处于稳定状态,而后选中主液流框的sweet spot 键，仪器会自动维持液流稳态。上样Accudrop beads 微球调节液滴延迟为30.31，使得微球在initial 或fine tune 模式下都达到侧液流偏转以99%以上。上样后通过空白和阴性对照管调节仪器参数圈定阳性细胞，分FVS510-CD3-CD19-NK1.1+NKp46+的NK 细胞，接收管中预置0.5 ml 培养基接收分选所得细胞。

1.3.4 分选后纯度检测 吸取400 μl 分选后的细胞上流式细胞仪，在原分选方案中检测分选后细胞的纯度。

1.3.5 分选后细胞存活率检测 吸取新提取的细胞悬液90 μl，加入0.4%台盼兰溶液10 μl，充分混匀后，加入改良的牛鲍计数板，显微镜下观察细胞见未被染色细胞为活细胞。细胞存活率=染色阴性细胞数/细胞总数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析。计量资料以（）表示，进行单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞仪液流断点及液滴延迟 第一滴液流断点位置Drop1 为345，Gap 为9，液流开启0.5 h 以上无晃动，无断点位置改变，稳定性良好，各种参数符合分选条件，见图1。

图1 调节后稳定的液流断点状态和液滴延迟调节结果

2.2 流式细胞仪检测并分选NK 细胞 分选前NK 细胞占总细胞（4.40±1.20）% Total，分选后为（96.10±2.20）% Total，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 分选前后NK 细胞纯度比较

2.3 分选后NK 细胞存活率 经台盼蓝染色显示分选后细胞存活率为（95.70±2.02）%，细胞形态良好，见图3。

图3 台盼蓝染色分选后NK 细胞（×100）

3 讨论

NK 细胞是先天免疫系统的重要组成部分[5-7]，是一类独特的淋巴细胞亚群，NK 细胞不同于T 细胞、B 细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的淋巴细胞，占外周血淋巴细胞总数的10%～15%。NK 细胞在小鼠肺脏含量仅次于脾脏，得到高纯度高活性的NK 细胞对于研究其功能具有重要意义。目前常用的细胞纯化方法主要有磁珠分选法和流式分选法[8，9]，磁珠分选多用于脾，血液等易于获取单细胞的组织，经过阴性选择和阳性选择两步可得到纯化率约90%的NK细胞[10，11]。而流式分选法对于稀有细胞和成份混杂的组织样品的分选具有更大的优势。

在小鼠中，NK 细胞通常被定义为CD3-NK1.1+或者CD3-NKp46+，NK 细胞的亚群划分主要依据CD11b、CD27、KLRG1 和CD226 等分子的表达[12-14]，由于NK 细胞存在于非T、B 淋巴细胞群，因此选取CD3-CD19-NKp46+NK1.1+细胞群为目的细胞进行分选，而在抗体选择上，标记T、B 细胞的CD3、CD19，选择同样荧光素标记的抗体，可简化实验的配色方案。由于分选的样品来源于组织，经过消化和离心过程会产生死细胞，死细胞的存在会增加非特异着色，同时也会影响分选后细胞的纯度和活性，因此，在进行染色结果分析时，需加入识别细胞死活的染料。目前流式多用的细胞死活染料分为两大类，核酸染料和氨基反应性染料[15]，核酸染料以7-AAD 为主，主要适用于非固定细胞的表面标记物的染色。7-AAD 的优点在于染色快捷，样品上机前加入，无需洗涤，缺点是7-AAD 的激发和发射光谱范围较宽，且与Percp，PE-CY5 等荧光染料存在较大光谱重叠，检测时应注意调节补偿或避免共同使用。氨基反应性染料适用于活细胞和破膜固定的细胞的死活染色，染色后需要洗涤，根据仪器激光配置和配色方案有多种光谱的染料可供选择。本实验中选择的细胞死活染料为FVS510，与FITC 存在一定漏光，样品检测时需设立单阳样品或荧光补偿微球调节FVS510 与FITC 之间的补偿值。

对于FACSAriaⅢ型流式细胞仪，选择85 μm喷嘴，控制上样速度为8000～10000 evts/s，是较适宜的分选条件，得到的NK 细胞数量和活力俱佳。上样速度过高会使得分选回收率下降，造成部分阳性细胞被丢弃，分选速度过低会延长分选时间，不利于维持细胞活性[16]。在流式细胞仪分选设置上，首先要注意调节稳定的液流参数，液流的稳定是保证分选准确进行的基础，分选过程中开启液流“sweet spot”模式，一旦液流不稳定时分选能够自动停止，防止液滴飞溅污染影响收集管中细胞的阳性率。此外，液滴延迟的调节是十分重要，可自动结合手动重复调节确定正确的Drop delay 数值，一旦液流参数发生变化，需要重新校准Drop delay，这些是保证分选进行的基本条件。通过上述手段，可将含量为（4.40±1.20）% Total 的NK 细胞富集到（96.10±2.20）% Total，且活细胞数量达到95%以上，细胞形态良好，可用于后续的实验研究。

综上所述，利用流式细胞分选仪可快速高效分离小鼠肺脏NK 细胞，分选后的细胞保持良好的活性，为进一步研究NK 细胞提供了保证。