翼茎羊耳菊提取物对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞RAW 264.7的抗炎作用

黄 春 丽， 吴 乐 昊， 于 洋， 金 慧 子， 张 岩

( 1.上海交通大学 药学院， 上海 200240；2.上海交通大学 生命科学技术学院， 上海 200240 )

0 引 言

炎症是机体对外界损伤产生的一种复杂的防御反应，在保护机体、防御外来病原体的感染中发挥重要作用。一般认为炎症是一种有益的宿主防御系统，但是过度、失调的炎症反应就会有害。在失调的炎症反应中，复杂的炎症介质包括促进炎症的细胞因子和具有细胞毒性的细胞因子等会伴随不同疾病的发生发展，包括肺炎[1]、关节炎[2]、慢性支气管炎[3]、风湿病[4]等，甚至包括一些神经退行性疾病例如阿尔茨海默病[5]。近年来，各类炎症性疾病发病率持续走高，且呈不断上升趋势，甚至已经成为全球性疾病[6]，寻找并发现安全有效的治疗炎症性疾病的药物的需求在不断上升。

炎症性疾病的发病机理的重要特征即炎症反应。巨噬细胞是重要的固有免疫细胞和抗原提呈细胞，炎症发生时，巨噬细胞被招募到炎症部位，并被外界物质刺激分泌产生细胞因子和趋化因子，同时启动细胞内级联反应[7]，产生炎症。巨噬细胞被募集到炎症部位释放炎症介质，在机体的炎症反应过程中发挥重要作用[8]，因此抑制炎症介质的释放以及相关的信号通路的激活是缓解炎症的重要手段。脂多糖(LPS)作为一种重要的内毒素，可以诱导巨噬细胞产生多种炎症因子以及炎症介质，如：肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、一氧化氮(NO)等[9]。LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞产生炎症反应，是评价药物抗炎活性以及进行机制研究的经典细胞模型[10]。

翼茎羊耳菊是我国特有的药用植物，在云南边陲应用广泛，主要用作脉管炎的治疗。在《滇药录》中记载，翼茎羊耳菊还可用于根治痈疮肿毒，气管炎，跌打损伤，气虚头昏等病症[11]；而在《滇省志》中，其还可用于根治肺虚咳嗽等[12]。但目前对其化学成分和药理作用尚知之甚少[13]。本研究采用脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞产生炎症反应，以期评价翼茎羊耳菊的抗炎活性并探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RPMI1640培养基，Hyclone公司；胎牛血清，Gibco公司；二甲基亚砜、小白菊内酯，Sigma公司；NO试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；Trizol试剂，Thermo Fisher Scientific公司；TaKaRa试剂盒，东洋纺(上海)生物科技有限公司；SYBR Green qPCR试剂，DBI Bioscience公司；Anti-ERK抗体、Anti-P-ERK抗体、Anti-p65抗体、Anti-P-p65抗体、Anti-β-actin抗体、Anti-iNOS抗体、Anti-p38抗体、Anti-P-p38、Anti-Akt抗体、Anti-P-Akt抗体、Anti-JNK抗体、Anti-P-JNK抗体，Cell Signaling公司；ELISA试剂盒，Thermo Fisher Scientific公司、欣博盛。

小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，中国细胞系库(北京)。

1.2 翼茎羊耳菊的提取

将干燥的翼茎羊耳菊(鉴定人：张君，云南昆明植分生物技术有限公司)全草粉碎后，用95%的乙醇进行回流提取，获得提取液，即为总提取物(ZT)；将总提取液在旋蒸仪上浓缩旋干，将获得的旋干后固体用石油醚萃取，即为石油醚部位(PE)；将石油醚部位再用乙酸乙酯萃取，即获得乙酸乙酯萃取液，进一步旋干即为乙酸乙酯部位(EA)；将乙酸乙酯萃取液进一步用正丁醇萃取，旋干即获得正丁醇部位(n-BuOH)，剩余为水溶性组分(H2O)。

1.3 细胞培养

将小鼠巨噬细胞系RAW 264.7培养在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 U/mL 链霉素的RPMI 1640完全培养基中，并放置在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中。

1.4 NO释放实验

将RAW 264.7巨噬细胞以3×104每孔铺于96孔板，贴壁后分别加入对应浓度药物和阳性对照药物小白菊内酯(10 μmol/L)预孵育1 h后，加入100 ng/mL LPS，于37 ℃培养23 h。用Griess法测量培养基中累积的亚硝酸盐作为NO产生的指标。将50 μL细胞培养液、50 μL Griess Ⅰ和50 μL Griess Ⅱ加入96孔板中，室温孵育10 min，用酶标仪在540 nm处检测其吸光度。

1.5 MTT法检测细胞活力

RAW 264.7细胞以1.0×103每孔铺于96孔板，贴壁后加入相应浓度药物于37 ℃孵育24 h，加入5 mg/mL的MTT 10 μL，于37 ℃孵育 4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL DMSO，避光孵育10 min，用酶标仪在490 nm处检测吸光度。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

采用TRIZOL法提取细胞总的mRNA，通过Nanodrop检测mRNA的浓度以及纯度。根据TaKaRa试剂盒说明进行操作，将mRNA反转录成cDNA，待测基因的引物作为模板，通过荧光定量PCR进行检测。以GAPDH为内参进行定量分析，引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 蛋白免疫印迹(Western Blot)

通过十二烷基硫酸钠(SDS)裂解细胞，收集裂解后的蛋白，于99 ℃加热10 min。通过SDS-PAGE凝胶电泳对iNOS、ERK、P-ERK、p38、P-p38、JNK、P-JNK、p65、P-p65、Akt、P-Akt蛋白进行免疫印迹检测。通过双色红外激光成像仪检测蛋白变化，用ImageJ软件进行图像分析并进行半定量分析。

1.8 酶联免疫吸附(ELISA)实验

根据IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA试剂盒说明书进行操作，采用夹心法检测细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。操作步骤如下：

捕获抗体工作液100 μL过夜包被96孔板，移去液体，清洗孔板；加入100 μL待测样品，并在室温孵育2 h，移去液体并清洗孔板；加入100 μL检测抗体工作液，室温孵育1 h，弃去液体并清洗孔板；加入100 μL酶结合物工作液，室温孵育30 min 弃去上清液并清洗孔板；加入100 μL底物显色液(TMB)，孵育15 min，加入50 μL终止液，立即用酶标仪于450 nm波长处测量吸光度。

1.9 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.3(GraphPad，Avenida，CA，USA)统计数据，结果表示为(平均值±标准误差)。采用t检验分析数据，当P<0.05 时，认为结果差异性有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 翼茎羊耳菊组分对LPS诱导的RAW 264.7细胞产生NO的影响

NO的产生是RAW 264.7细胞产生炎症反应的显著标志之一，因此检测药物孵育后对LPS诱导的RAW 264.7细胞上清液中NO含量的影响，可以作为评价药物抗炎活性的评价指标之一[15]。本研究根据组分极性的差异，将翼茎羊耳菊提取物分为n-BuOH、PE、EA和水溶性组分。通过检测所得组分对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO释放的影响进行抗炎活性评估，小白菊内酯(P)作为阳性对照。如图1(a)所示，LPS刺激23 h后，RAW 264.7细胞上清液NO浓度明显上升，而组分n-BuOH、PE和EA在50和10 μg/mL对LPS诱导RAW 264.7细胞产生的NO均有不同程度的抑制效果，其中EA效果最优。因此，在后续的实验中，以EA为主要研究对象。

测定了乙酸乙酯组分对NO抑制作用的剂量效应曲线，如图1(b)所示，可见乙酸乙酯组分可以剂量依赖的抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞释放NO，由剂量效应曲线得IC50为1.675 μg/mL。

为了排除细胞活力对NO释放的影响，采用MTT的方法检测不同剂量下药物对细胞活力的作用。MTT结果如图1(c)所示，在50 μg/mL剂量下，乙酸乙酯组分对细胞活力影响较为显著，因此，选择5、10、20 μg/mL进行后续实验。

P，小白菊内脂-阳性组；C，空白组；LPS，阴性组与空白组相比，####P<0.000 1；与阴性组相比，**P<0.01，***P<0.001，*****P<0.000 1

2.2 翼茎羊耳菊乙酸乙酯组分[IP(EA)]对RAW 264.7细胞中iNOS mRNA及其蛋白表达水平的影响

NO是机体内重要的信号分子，参与细胞信息交流，具有调节免疫、炎症等重要的生理功能，在生物体内NO的合成受到一氧化氮合成酶(NOS)的调控[16]。在巨噬细胞中NO主要由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)催化合成[17]。iNOS在巨噬细胞当中同时也是协助其进行免疫反应的一类酶。检测药物对iNOS表达量的影响可以进一步考察药物是否通过调控iNOS从而对NO产生抑制作用的。本研究从mRNA和蛋白水平分别检测了iNOS表达的变化。RAW 264.7细胞与IP(EA)预孵育1 h后，加入LPS刺激23 h，发现IP(EA)能够剂量依赖性地降低LPS诱导产生的iNOS mRNA的表达(图2(a))和蛋白的表达水平(图2(b))。研究结果表明，IP(EA)通过抑制iNOS的表达抑制了NO的产生。

(a) IP(EA)对LPS诱导iNOS的影响

2.3 IP(EA)对LPS诱导RAW 264.7细胞产生IL-6、IL-1β、TNF-α的影响

IL-1β、IL-6以及TNF-α在炎症反应中起到促进炎症的作用，属于促炎因子，可以分别与靶细胞膜上的相应受体结合激活炎症相关的信号通路，从而影响炎症反应的进程[18]。RAW 264.7作为小鼠的巨噬细胞系在被LPS等物质的刺激情况下可以分泌大量的炎性因子，在促进炎症的发生发展中起到重要作用[18]。本研究从mRNA水平和蛋白水平考察了IP(EA)是否能够抑制 IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子的产生。如图3(a)～(c)所示，RAW 264.7细胞在LPS刺激下IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平显著上升，而IP(EA)给药组能够浓度依赖性的抑制这些炎症因子的表达。ELISA检测结果(图3(d)～(f))表明，RAW 264.7细胞在LPS刺激下IL-6、IL-1β、TNF-α的蛋白表达量显著升高，而IP(EA)在5、10、20 μg/mL能够浓度依赖地显著抑制LPS诱导的IL-6蛋白水平，在10和20 μg/mL能够显著降低IL-1β和TNF-α的表达。

(a) 对IL-6 mRNA水平的影响

2.4 IP(EA)对LPS诱导的MAPK通路的影响

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是细胞内一条非常重要的信号通路，主要包括细胞外信号调节激酶(ERK通路)、p38丝裂原蛋白激酶(p38通路)和c-Jun氨基末端激酶(JNK通路)3个亚族[19]。MAPK信号通路是重要的炎症相关的经典通路，MAPK的3个亚族ERK、JNK、p38都和炎症相关，这些通路的激活将促使细胞释放IL-6、IL-1β等炎症相关物质。在RAW 264.7细胞未被激活处于静息状态时，MAPK通路不会被激活；而RAW 264.7细胞在LPS刺激下，MAPK通路会被迅速激活，ERK、p38、JNK等通路会发生磷酸化[20]。为了探究IP(EA)是否是通过抑制MAPK信号通路而发挥抗炎作用，IP(EA)与RAW 264.7细胞孵育1 h后，LPS刺激30 min，采用蛋白免疫印迹检测磷酸化的ERK、p38、JNK。如图4(a)～(c)所示，LPS能够显著提高ERK、p38、JNK的磷酸化，而IP(EA)在10和20 μg/mL 条件下能够剂量依赖性地显著抑制这些蛋白的磷酸化。因此，IP(EA)是通过抑制MAPK通路而发挥抗炎活性的。

(a) 对ERK蛋白磷酸化的影响

2.5 IP(EA)对LPS诱导的Akt/NF-κB通路的影响

NF-κB信号通路的激活可诱导炎症因子如TNF-α、趋化因子以及一些和炎症级联放大相关的酶如iNOS等的过度表达，从而导致炎症的发生[14]。NF-κB家族包括p65(RelA)、C-Rel、RelB、p50/NF-κB1和p52/NF-κB2五个部分。NF-κB信号通路的激活是LPS诱导iNOS以及多种炎症因子大量表达的关键通路[21]。因此，检测了IP(EA)是否抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的活化。在细胞处于非激活状态下，p65与IκB蛋白结合并处在细胞质中，而一旦细胞受到外界刺激，IκB蛋白上游激酶磷酸化激活，使得IκB降解，从而释放出p65并进入细胞核，同时p65磷酸化[22]。本实验中，如图5(a)所示，LPS刺激RAW 264.7细胞后，p65的磷酸化显著增加，而IP(EA)能够显著抑制p65的磷酸化。

蛋白激酶B(Akt)蛋白是由原癌基因编码的一种丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，有研究表明Akt处于NF-κB的上游，其磷酸化会激活NF-κB信号通路，从而进一步调控细胞增殖、炎症反应等生理过程[23-24]。Akt作为IκB蛋白上游激酶，Akt发生磷酸化时会导致p65活化。因此，进一步检测IP(EA)对AKT磷酸化的影响，如图5B所示，LPS能够显著诱导Akt的磷酸化，而IP(EA)能够剂量依赖性的降低LPS诱导的Akt的磷酸化。由此表明，IP(EA)是通过抑制Akt/NF-κB信号通路从而发挥抗炎作用。

(a) 对p65蛋白磷酸化的影响

3 结 论

研究发现，翼茎羊耳菊提取物的乙酸乙酯组分抗炎活性最为明显，在LPS诱导的RAW 264.7细胞上，IP(EA)可以通过影响iNOS的表达而抑制细胞内NO的产生；在mRNA以及蛋白水平均可以显著抑制炎性因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达。IP(EA)显著抑制了LPS诱导的RAW 264.7细胞内MAPK、p65以及Akt的磷酸化，表明MAPK、NF-κB以及Akt信号通路参与了IP(EA)的抗炎过程。