mXG/HBC复合可注射温敏水凝胶对粘连松解术后二次损伤的作用

陈 泽，胡梓骐，蒋丽杰，李景武，陈 静，陈 敏，张 昊，张二帅，孙 红

0 引 言

粘连松解术是目前临床上常用解除腹腔粘连的方法[1-2]，但由于术中又会造成新的创伤，因而可能导致粘连松解的部位发生再次粘连[3]。现有防粘连材料的相关研究主要针对于普通手术创伤所造成的粘连[4]，而针对粘连松解术后再粘连预防的研究相关报道较少。

粘连松解手术对粘连组织所造成的创伤较常规外科手术创伤所导致的粘连更为严重，且再粘连的形成机制也更加复杂[5-8]。Yeo等[9]通过将带有醛基和氨基的透明质酸交联后得到的原位透明质酸水凝胶，在兔的腹壁-盲肠缺损模型中显示出了良好的防粘连效果，但仅有单纯物理隔离作用的透明质酸水凝胶并不能有效地的预防粘连松解术后再粘连的发生。本研究前期利用绿色酶解反应制得了具有反向“低温溶胶，体温凝胶”温敏特性的改性木葡聚糖(modified xyloglucan, mXG)温敏水凝胶[10-11]。mXG凝胶在用于预防腹腔粘连及粘连松解术后二次粘连的预防时发现，mXG凝胶虽然可以起到很好的防粘连作用[12]，但不能抑制炎症反应的发生。因此，本研究将具有抗菌、抗炎作用的壳聚糖[13-14]，通过醚化反应将羟丁基基团引入壳聚糖分子链，制备水溶性的羟丁基壳聚糖(hydroxybutyl chitosan, HBC)，拟探究mXG/HBC复合可注射温敏水凝胶对粘连松解术后二次损伤的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠及主要试剂、仪器清洁级健康雄性SD大鼠110只，体重180～220 g，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验大鼠中心。动物许可证号：SCXK-(京)2014-0004。所有大鼠在温度(22±2)℃，相对湿度(50±5)%环境下单笼饲养，期间提供充足的水和饲料，实验前保证至少一周的适应性饲养，术前12 h对大鼠禁食。mXG和HBC均由天津大学化工学院合成；医用壳聚糖防粘连膜粘停宁(Film)购自烟台万利医用品有限公司；等渗盐水购自齐鲁制药有限公司；碘尔康购自上海利康消毒高科技有限公司。

1.2腹壁-盲肠粘连松解术后二次损伤粘连模型的建立选用110只SD大鼠建立腹壁-盲肠一次损伤模型。操作步骤：大鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，备皮、消毒、铺手术洞巾。沿下腹部皮肤中心线开长度约5 cm的切口剪开腹壁。用手术刀在腹壁轻微磨刮，使之形成一个面积为1×2 cm2，深0.5 mm的出血区域。形成出血后在与腹壁创面相对应的盲肠表面使用手术刷轻轻磨擦，直到盲肠浆膜层被破坏至有明显的点状出血，用5-0缝合线固定，使得创面与盲肠受损处完全的贴合，缝合关腹完成模型。术后1周，对大鼠进行二次开腹手术，使用钝器或锐器对形成的腹膜粘连进行松解，用手术刷反复摩擦分离后的腹壁创面直至再次形成出血表面；然后用手术刷在分离后的盲肠创面部位轻轻磨擦，直到肠粘膜再次被破坏至有明显的渗血，至此完成对粘连松解术后腹壁和盲肠的二次损伤模型的建立，关腹后使用碘尔康对伤口消毒。

1.3大鼠分组及处理在第一次损伤后发生粘连的大鼠中选择80只粘连评分接近的大鼠，对其实施粘连松解术，并进行二次损伤，随机分为5组(每组16只)：对照组(等渗盐水)、Film组(壳聚糖防粘连膜)、mXG组(注射4%，w/v改性木葡聚糖凝胶)、HBC组(注射5%，w/v羟丁基壳聚糖凝胶)、mXG/HBC组(注射4%/5%，w/v改性木葡聚糖/羟丁基壳聚糖复合凝胶)。对于mXG组、HBC组和mXG/HBC组，分别将1 mL温敏凝胶注射至粘连松解术后二次损伤的腹壁和盲肠创面，待凝胶完全固化后关腹；对于Film组，将2×3 cm2的壳聚糖防粘连膜覆盖于二次损伤的腹壁创面后关腹；对照组在关腹前将1 mL等渗盐水注射于腹壁和盲肠的创面。

1.4温敏水凝胶防粘连效果评分经过7 d和14 d的正常饲养，通过腹腔注射过量水合氯醛分别处死各组中的大鼠，开腹后检查腹壁与盲肠的粘连情况，并按照粘连的评分标准对粘连进行评分[15]。广泛而致密的血管化粘连为5分，有不止一处的致密粘连为4分，有比较致密的粘连为3分，有不止一处的疏松粘连为2分，腹腔内有一处薄的粘连为1分，完全无粘连为0分。实验采用双盲设计，打分者不参与手术。

1.5温敏水凝胶防粘连效果组织学评价对于粘连区域，切取腹壁-盲肠粘连部位的组织；对于未粘连的区域，分别切取腹壁和盲肠的创面组织，使用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，分别对同一部位进行HE、Masson和Van Gieson染色后，使用光学显微镜观察组织学形态。

2 结 果

2.1 温敏水凝胶防粘连效果观察术后7 d，对照组和Film组所有的大鼠盲肠和腹壁发生了明显的粘连。mXG组仅1只轻微粘连，腹壁愈合创面面积较初始减小。HBC组所有大鼠均发生粘连。mXG/HBC组仅2只大鼠发生轻度粘连，腹壁创面已经完全愈合，愈合创面表面光洁平整，新生间皮层已完全将创面覆盖。见图1。

图示对照组、Film组和HBC组盲肠和腹壁发生了明显的粘连，而mXG组和mXG/HBC组盲肠和腹壁没有发生粘连黑色箭头：盲肠和腹壁发生粘连；红色箭头：未发生粘连的盲肠；蓝色箭头：未发生粘连的腹壁

术后14 d，对照组所有大鼠形成粘连。Film组7只大鼠出现严重的粘连。mXG组仅2只大鼠轻度的粘连，腹壁和盲肠的创面均已完全愈合，没有凝胶。HBC组所有大鼠均发生粘连。mXG/HBC组除1只有轻微粘连外，其余大鼠均未发生粘连，腹壁创面已经完全愈合，愈合创面表面光洁平整。见图2。

图示对照组、Film组和HBC组盲肠和腹壁发生了明显的粘连，而mXG组和mXG/HBC组盲肠和腹壁没有发生粘连黑色箭头：盲肠和腹壁发生粘连；红色箭头：未发生粘连的盲肠；蓝色箭头：未发生粘连的腹壁

2.2术后防粘连效果评分术后第7、14天时，与mXG组粘连评分比较，对照组、Film组明显升高(P<0.05)；与mXG/HBC组比较，HBC组粘连评分明显升高(P<0.05)。见表1。对照组在术后7 d所有的大鼠都发生了4-5分的严重粘连，14 d时大部分形成了5分粘连；Film组术后7 d的粘连主要集中在3-4分，14 d时大多形成4～5分的粘连；HBC组在7 d和14 d发生4～5分的严重粘连。术后7 d，mXG组、mXG/HBC组分别7、6只未发生粘连；术后14 d，mXG组、mXG/HBC组6、7只未发生粘连。

表1 术后防粘连效果评分分)

2.3防粘连效果组织学观察术后第7天，对照组、Film组和HBC组大鼠腹壁和盲肠之间存在粘连，且粘连区域存在大量的胶原纤维，图3虚线内区域为形成的致密结缔组织。mXG组腹壁和盲肠的创面组织恢复，但存在大量的炎性细胞和巨噬细胞渗出。mXG/HBC组无凝胶，愈合创面层次清晰、厚度均一、修复良好。见图3。

术后14 d，对照组和HBC组粘连区域的胶原纤维沉积增多，厚度较第7天增加，粘连致密且部分区域有新生血管。HBC组粘连区域炎性细胞的数量减少。Film组粘连区域较第7天致密。mXG组新生间皮层下纤维蛋白沉积物减少，但创面表层不平整。mXG/HBC组盲肠和腹壁愈合表面平整，炎性细胞数量较第7天明显减少，而且愈合创面组织变薄。见图4。

图示对照组、Film组和HBC组盲肠和腹壁发生了粘连，而mXG组和mXG/HBC组盲肠和腹壁没有发生粘连

图示对照组、Film组和HBC组盲肠和腹壁发生了粘连，而mXG组和mXG/HBC组盲肠和腹壁没有发生粘连。

3 讨 论

临床研究显示，粘连松解术后再粘连的发生率达50%[16-17]，直至目前腹腔术后粘连发生机制还未得到彻底的阐明，临床上对粘连的防治手段仍存在许多不足，因此预防粘连的发生一直以来是腹部外科研究的重点和难点。

感染是导致术后粘连的诸多因素之一[18]，尤其是对于腹腔损伤，由于创面暴露于富含大量腹腔液的潮湿环境中，极大地提高了细菌感染的概率，从而增加了术后粘连的发生率[19]。本课题组前期研究表明[10]，mXG凝胶具有优良的“低温溶胶，体温凝胶”的温敏特性，可产生较好的物理隔离作用，用于体内后其降解产物对机体不产生毒性。本研究表明mXG凝胶具有良好的术后防粘连效果，但其本身不具有抗菌、抗炎性能[12]，而HBC凝胶具有抗菌、抗炎性能。因此，本课题组研究将两种材料进行共混得到mXG/HBC复合体系，通过大体观察、粘连评分和组织学评价mXG/HBC复合凝胶的防粘连效果。

综合粘连程度评分和大体观察结果表明，术后7 d、14 d mXG组和mXG/HBC组中绝大对数的大鼠都没有发生粘连，HBC组中，所有大鼠都发生4～5分的严重粘连，表明mXG和mXG/HBC复合凝胶能够有效地预防粘连松解术后再次粘连的发生，而HBC凝胶对于粘连松解术后再次粘连的发生几乎没有起到预防的效果。

组织学观察表明，对于mXG组，腹壁和盲肠的表层已经出现了一层分布均匀、层次清晰的新生间皮层，同时在间皮细胞层下方出现纤维化组织，同时可见大量的炎性细胞和巨噬细胞，表明mXG虽然有缓解腹腔粘连的作用，但不具有抗炎作用。对照组、Film组和HBC凝胶组中，粘连区域产生了大量的胶原纤维，14天时部分区域还可看到新生血管，而胶原纤维的大量沉积正是引发腹壁和盲肠创面形成粘连的关键，但HBC组中的炎症反应明显低于mXG组，表明其具备抗炎作用。在mXG/HBC组中，腹壁愈合状况非常好，表层出现了一层分布均匀且平整的新生间皮层，整个愈合的创面层次清晰，厚度均一盲肠的创面也得到一定程度的修复，表明mXG/HBC复合凝胶既可防治粘连形成，又具有减轻炎症反应的效果。

综合分析可知，商业化防粘连膜在腹壁-盲肠粘连松解术后二次损伤粘连模型中虽然能够在一定程度上减轻粘连的严重程度，但是并不能起到预防粘连的效果，这是因为将防粘连膜用于二次损伤的创面时，它在创面渗血和腹腔液的作用下会很快变为粘稠的溶液状态，不能有效的维持于创面发挥物理阻隔作用，从而导致了其难以有效地预防手术后的粘连。mXG凝胶因具有很高的强度(780 Pa)，可以有效的维持于创面发挥物理阻隔作用，HBC凝胶在用于术后防粘连时，除了能够发挥物理屏障作用外，其复合凝胶还具有抑制成纤维细胞的增生、降低胶原纤维的产生以及促进内皮细胞生长的作用，从而能够促进创面的愈合，减少粘连的发生；同时，HBC通过对一些生长因子的调控，还可以使胶原的分泌和沉积减少，在预防粘连的同时还减少了瘢痕的形成。此外，由于HBC还具有很好的抗菌活性，因此复合凝胶在用于术后防粘连时还能有效预防各种腹腔细菌所导致的感染，降低炎症反应的发生从而提高防粘连效果。

以上结果表明，mXG/HBC复合凝胶不仅能够有效地预防粘连松解术后再次粘连的发生，还能降低炎症反应、促进创面愈合，其为mXG/HBC复合凝胶今后应用于临床研究腹腔再粘连奠定了理论基础并提供了实验依据。