双功能碳点用于葡萄糖的比色/比率荧光测定

袁春玲，姚晓条，徐远金，覃 秀，石 睿，成诗琦，王益林

（广西大学化学化工学院,广西电化学能源材料重点实验室,南宁 530004）

葡萄糖是生物活动中主要的能量来源和代谢中间体，在生命运行过程中起着重要作用，血糖水平异常通常被认为与糖尿病、低血糖及代谢紊乱等疾病有关［1，2］.因此，快速和准确测定血清中葡萄糖的浓度对疾病诊断具有重要意义.目前，色谱分析［3，4］、电分析［5，6］和光分析［7，8］等检测技术已被应用于葡萄糖的测定.因具有响应快、成本低和灵敏度高等优点，比色和荧光等光分析技术备受关注［7］.随着纳米科技的不断发展，各种纳米材料在光分析领域的应用日益广泛.一些金属氧化物［9］、金属硫化物［10］及贵金属［11］纳米材料因具有类过氧化物酶特性，可催化H2O2氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）而用于葡萄糖的比色测定.因吸收谱带宽和摩尔吸光系数大，MnO2纳米片可有效猝灭稀土纳米颗粒（NaYF4∶Yb，Tm＠NaYF4nanoparticles）［12］及铜纳米簇（Copper nanoclusters）［13］的荧光；而H2O2的加入可将MnO2还原为Mn2+，使被猝灭的荧光得到恢复.结合葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成H2O2的原理，上述纳米材料已用于构建测定葡萄糖浓度的“off-on”型荧光探针.迄今，采用比色或荧光法测定葡萄糖的研究报道较多，但鲜见同时用这2种方法测定葡萄糖的报道［14，15］.研究［14，15］表明，ZnFe2O4磁性微球、Pd纳米颗粒能催化H2O2氧化邻苯二胺（OPD）生成能发荧光的黄色产物2，3-二氨基吩嗪（DAP）；DAP的存在会导致硼和氮共掺杂的碳点（B，N-CDs）、C3N4纳米片的荧光猝灭.据此，Li［14］和Qiu课题组［15］分别发展了一种基于比色和比率荧光的双信号葡萄糖测定新方法，均用到了2种纳米（或微米）材料.

与其它纳米材料相比，CDs具有制备简单、稳定性高、生物相容性好及发光能力强等优点［16］.作为类过氧化物酶或荧光纳米材料，CDs在生化分析及细胞成像等研究领域应用广泛［17～22］，但同时具有类过氧化物酶活性和荧光发射特性的双功能CDs的报道较少［23～25］.采用苦楝树叶（Azadirachta indica leaves）［23］和芥菜种子（Mustard seeds）［24］等生物质材料制备的CDs既能发射荧光，也能催化H2O2氧化TMB，但相关研究只将其催化功能应用于H2O2和抗坏血酸的测定；以有机胺和硝酸铁为反应物可制备双功能的铁、氮共掺杂CDs，该双功能CDs可用于黄嘌呤的比色/比率荧光测定［25］.元素掺杂不仅能够提高CDs的荧光量子产率，而且可以改变CDs的内部电子环境，赋予CDs新的功能，拓宽其应用领域［26］.基于铁元素在过氧化物酶中的关键作用和氮掺杂能改善CDs的荧光特性，本文以生物质（合果芋叶片）、十二水合硫酸铁铵和脲为起始物，通过水热法制备了铁、氮共掺杂的CDs（Fe，N-CDs），所得Fe，N-CDs既具有类过氧化物酶活性，也能在450 nm处产生强荧光发射（图1）.基于Fe，N-CDs的双功能特性，建立了一种比色/比率荧光测定葡萄糖浓度的方法，并成功应用于实际样品分析.

Fig.1 Preparation and properties of Fe,N-CDs

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

十二水合硫酸铁铵［NH4Fe（SO4）2·12H2O］、脲（N2HCONH2）、三水合乙酸钠、冰醋酸和过氧化氢（广东光华科技股份有限公司）；葡萄糖、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、色氨酸和丝氨酸（天津市大茂化学试剂厂）；邻苯二胺（OPD，上海阿拉丁试剂有限公司）；葡萄糖氧化酶（北京索莱宝科技有限公司）.所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水.

RF-5301PC型荧光分光光度计（日本岛津公司）；UV-4802型紫外-可见分光光度计（上海龙尼柯公司）；Tecnai G2 F20 S-Twin型透射电子显微镜（美国FEI公司）；Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞世尔公司）；FLS1000型荧光光谱仪（英国爱丁堡公司）.

1.2 Fe,N-CDs的制备

将合果芋叶片洗净，晾干表面的湿存水后剪碎，称取2.0 g置于75 mL反应釜中，加入0.8 g NH4Fe（SO4）2·12H2O，0.2 g N2HCONH2和25 mL去离子水，混合均匀后密封；将反应釜置于180℃恒温干燥箱中加热6 h.待自然冷却至室温后，先用漏斗过滤，得深棕色溶液；再用0.22μm微滤膜去除溶液中的大颗粒聚集物；将反应溶液透析24 h以除去未反应的试剂，收集袋内溶液并定容到25 mL，保存于4℃冰箱中备用.

1.3 H2O2和葡萄糖的测定

H2O2的测定：在系列比色管中，依次加入0.5 mL不同浓度的H2O2溶液、0.5 mL 17.5 mmol/L OPD溶液和100μL Fe，N-CDs溶液，混合均匀后，用pH=5.4的HAc-NaAc（0.2 mol/L）缓冲溶液定容到5.0 mL，置于40℃水浴中反应25 min.分别在330～550 nm范围内扫描其吸收光谱，在360 nm波长光的激发下记录荧光光谱，实验平行进行3次.

葡萄糖的测定：在系列比色管中，依次加入0.5 mL 10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（pH=7.0）缓冲溶液、0.5 mL不同浓度的葡萄糖溶液和0.1 mL 2.0 mg/mL葡萄糖氧化酶，混合均匀后，在37℃水浴中培育30 min使之产生H2O2；随后，加入0.5 mL 17.5 mmol/LOPD溶液和100μL Fe，N-CDs溶液，并用0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲溶液（pH=5.4）定容到5.0 mL，混合均匀，后续过程与H2O2的测定相同，实验平行进行3次.

2 结果与讨论

2.1 Fe,N-CDs的表征

采用透射电子显微镜（TEM）对Fe，N-CDs的形貌和颗粒尺寸进行表征.由图2（A）可见，Fe，N-CDs呈近似球状，分散性好；从高分辨透射电子显微镜照片（插图）中可见清晰的晶格条纹，间距为0.23 nm，与石墨烯（100）面相对应［27］.根据Nano Measurer软件分析表明［图2（B）］，Fe，N-CDs的粒径主要分布在1.34～3.68 nm范围内，平均粒径约为2.51 nm.

Fig.2 TEMimage(A)and particle size distribution diagram(B)of Fe,N-CDsInset of(A)is the relative HRTEM image.

在365 nm紫外灯照射下，Fe，N-CDs发出明亮的蓝色荧光［图3（A）插图］.当激发波长从310 nm增加到440 nm时，Fe，N-CDs的荧光发射峰从427 nm红移到472 nm；荧光强度呈先升后降趋势；用360 nm波长的光激发时，荧光发射最强［图3（A）］.这种激发依赖的发射行为与颗粒的表面缺陷及颗粒大小有关［27］.Fe，N-CDs溶液在紫外区具有较强的光吸收，270 nm处的吸收峰归因于C=C或C=N的π-π*跃迁［28］（见本文支持信息图S1）.采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了Fe，N-CDs所含的基团［图3（B）］，3150 cm-1处的宽峰归属为O—H和N—H的伸缩振动，1630 cm-1处的峰归属为C=O和C=C的伸缩振动，1400和1120 cm-1处的峰分别归属为C—OH和C—O—C的伸缩振动.FTIR分析表明，Fe，N-CDs表面存在—COOH，—OH和—NH2等亲水基团，从而使其具有良好的水溶性.

Fig.3 Emission spectra of Fe,N-CDs excited at 310—440 nm(A)and FTIR spectrum of Fe,N-CDs(B)

采用X射线光电子能谱（XPS）对Fe，N-CDs的元素组成和所含官能团进行了表征.从全扫描谱图（图4）可以看出，CDs主要由碳（44.02%）、氮（13.41%）、氧（39.98%）和铁（2.59%）4种元素组成，结合能分别为284.8，401.3，531.5和710.7 eV.C1s的高分辨XPS谱图含有284.7，286.1和288.3 eV 3个峰，分别对应C=C，C=O和O—C=O官能团［29］.N1s的高分辨XPS谱图显示出399.8和401.5 eV 2个峰，分别对应C—N—C和N—H官能团［30］.O1s的高分辨XPS谱图中有531.3和532.4 eV2个峰，分别归属于C—OH/C—O—C和C=O键［31］.Fe2p谱图含有710.7，714.1，724.7和727.6 eV 4个峰，分别对应于［见本文支持信息图S2（A）～（D）］.以上结果表明，Fe和N 元素确已掺杂到CDs中；Fe，N-CDs表面具有丰富的含O和含N官能团.

Fig.4 Survey spectrum of Fe,N-CDs

2.2 Fe,N-CDs的催化活性及葡萄糖双信号测定机理

为研究Fe，N-CDs的类过氧化物酶活性，在pH=5.4的HAc-NaAc缓冲溶液中进行了对照实验.含Fe，N-CDs和OPD的溶液呈无色，UV-Vis谱图中无吸收峰［图5（A）谱线a］；含H2O2和OPD的溶液在420 nm处有1个弱吸收峰［图5（A）谱线b］，其溶液呈淡黄色，说明H2O2可以缓慢地将OPD氧化为DAP；当Fe，N-CDs存在时，含H2O2和OPD的溶液在420 nm处有1个强吸收峰［图5（A）谱线c］，其溶液呈深黄色.以上数据表明，Fe，N-CDs具有类过氧化物酶活性，能催化H2O2氧化OPD的反应.

DAP溶液呈黄色，其吸收峰位于420 nm处；在360 nm波长光的激发下，Fe，N-CDs的荧光发射峰位于450 nm处.由图5（B）可见，DAP的吸收光谱与Fe，N-CDs的荧光光谱有较大重叠；二者共存时，可通过荧光内滤效应（IFE）或荧光共振能量转移（FREF）导致Fe，N-CDs的荧光猝灭.加入Fe，N-CDs前后，DAP吸收峰的位置和吸收强度几乎无变化［见本文支持信息图S3（A）］，说明Fe，N-CDs与DAP之间并未形成配合物，即Fe，N-CDs与DAP之间不可能发生FRET［33］.此外，加入DAP前后，Fe，N-CDs的荧光寿命未发生明显变化［见本文支持信息图S3（B）］，说明Fe，N-CDs与DAP之间无电荷转移，故Fe，NCDs的荧光猝灭并非电荷转移所致［14］.因此，二者共存时，Fe，N-CDs的荧光猝灭是因IFE所致.

Fig.5 Absorbance spectra of different solutions in 0.2 mol/L HAc-NaAc buffer solution at pH=5.4(A)and absorbance spectrum of DAP and emission spectrum of Fe,N-CDs(B)Inset of(A)shows the corresponding photograph.

Fe，N-CDs可催化H2O2氧化OPD生成DAP；经360nm波长光激发，DAP在550 nm处有1个荧光发射峰，而在同一波长光的激发下，Fe，N-CDs在450 nm处也有荧光发射峰；DAP通过IFE而猝灭Fe，N-CDs的荧光.即在Fe，N-CDs/OPD体系中加入H2O2，不仅引起溶液颜色的变化，也会导致DAP和Fe，N-CDs相对荧光强度的变化；随着H2O2浓度的增加，DAP在420 nm处的吸光度和550 nm处的荧光强度均增加，而Fe，N-CDs在450 nm处的荧光强度则降低.通过测定DAP在420 nm处的吸光度及DAP与Fe，NCDs的荧光强度比（I550/I450）可确定H2O2浓度；而H2O2又是葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化的产物之一.据此，可进一步建立比色/比率荧光双信号葡萄糖测定方法（图6）.

2.3 实验条件的优化

为获得最佳的信号响应，以相对荧光强度I550/I450（其中I550和I450分别表示550和450 nm处的荧光发射强度）为指标，考察了pH、温度、反应时间及OPD浓度等因素对Fe，N-CQDs催化H2O2氧化OPD反应的影响.考虑到类过氧化物酶通常在弱酸性条件下表现出较强的催化活性，以HAc-NaAc缓冲液为介质，在5.0～6.2的pH值范围内考察了介质酸度对I550/I450值的影响.由图S4（A）（见本文支持信息）可见，随着pH的升高，I550/I450值呈现先增后减的变化规律，且当pH=5.4时，I550/I450值最大.因此，实验选择在pH=5.4的HAc-NaAc缓冲液中进行.常温下，Fe，N-CDs催化OPD氧化的速度较慢，反应体系的颜色变化不明显.图S4（B）（见本文支持信息）示出了Fe，N-CDs/H2O2/OPD混合液经30～60℃水浴孵育后，测得的I550/I450值与温度变化的关系，可见，40℃是比较适宜的温度.随着反应时间的延长，I550/I450值也随之增大，在25 min时基本达到稳定［见本文支持信息图S4（C）］，为保证获得最大荧光比和稳定的信号响应，选择25 min作为最佳反应时间.随着OPD浓度的增大，I550/I450值逐渐增大，当浓度为1.75 mmol/L时I550/I450值趋于平稳［见本文支持信息图S4（D）］.最终选定的实验条件为pH=5.4，温度40℃，反应时间25 min，1.75 mmol/L OPD.

Fig.6 Schematic diagram of detection principle

2.4 H2O2和葡萄糖的比色/比率荧光双信号检测

在优化的条件下，考察了H2O2浓度对体系吸收与荧光光谱的影响.紫外-可见吸收光谱测定结果表明，当H2O2浓度从1.0μmol/L增加到300μmol/L时，DAP在420 nm处特征吸收峰的波长不变，吸收强度逐渐增大［见本文支持信息图S5（A）］；且420 nm处的吸光度值（A420）与H2O2浓度呈良好的线性关系［见本文支持信息图S5（B）］，线性方程为A420=0.0039cH2O2+0.0087，相关系数为0.996.荧光测定结果表明，随着H2O2浓度的升高，DAP在550 nm处的荧光逐渐增强，而Fe，N-CQDs在450 nm处的荧光则逐渐减弱［见本文支持信息图S5（C）］.H2O2浓度在1.0～80μmol/L范围内，I550/I450值与H2O2浓度之间呈良好的线性关系［见本文支持信息图S5（D）］，线性方程为I550/I450=0.0039cH2O2+0.2606，相关系数为0.998.比色和比率荧光法的检出限（3σ/k）分别为0.7和0.6μmol/L，表明方法具有较高的灵敏度.

葡萄糖经葡萄糖氧化酶催化氧化后会产生H2O2，据此，可进一步建立双信号测定葡萄糖的方法.图7（A）显示了依赖于葡萄糖浓度的DAP的吸收光谱.随着葡萄糖浓度的增加，420 nm处的吸光度逐渐增大；在1.0～100μmol/L浓度范围内，DAP的吸光度与葡萄糖浓度呈良好的线性关系［图7（B）］，回归方程为A420=0.0038cglucose+0.0142（R2=0.991）.从图7（C）可以看出，随着葡萄糖浓度的增加，DAP在550 nm处的荧光强度增大，而Fe，N-CDs在450 nm处的荧光强度降低；在1.0～100μmol/L浓度内，I550/I450值与葡萄糖浓度成正比［图7（D）］，回归方程为I550/I450=0.0039cglucose+0.2237（R2=0.998）.比色和比率荧光法的检出限分别为0.8和0.6μmol/L，表明方法具有较高的灵敏度.方法的线性范围和检出限优于或可比于已报道的方法（表1）；且最终检测液颜色随葡萄糖浓度的升高而加深［图7（B）插图］，裸眼可辨别的最低浓度为5.0μmol/L，本方法可实现低浓度葡萄糖的可视化检测.

Fig.7 Absorption(A)and emission(C)spectra of Fe,N-CDs-OPD with different concentrations of glucose,linear relationship between A420 and glucose concentration(B)and linear relationship between I550/I450 and glucose concentration(D)Inset of(B)is the photograph of the solutions corresponding to(A).

Table 1 Comparison of different methods for detecting glucose

2.5 方法的选择性

为评价方法的选择性，选取血清中常见的金属离子如Na+，K+，Mg2+，Zn2+及系列氨基酸［苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、异亮氨酸（Ile）、苏氨酸（Thr）、天冬氨酸（Asp）、色氨酸（Trp）、缬氨酸（Val）和丝氨酸（Ser）］作为干扰物代替葡萄糖，经培育、显色后分别测定吸收与荧光信号.图8（A）和（B）分别示出了葡萄糖（Glu）浓度为0.1 mmol/L，各干扰物浓度均为1.0 mmol/L时的比色和比率荧光响应情况.尽管各干扰物的浓度是葡萄糖浓度的10倍，但只有葡萄糖能引起2种分析信号的显著变化，这与葡萄糖氧化酶的高选择性有关.因此，该方法的选择性良好.

Fig.8 Selectivities of colorimetric(A)and ratio fluorescence for glucose detection(B)The concentration of glucose was 0.1 mmol/L,of other substances was 1.0 mmol/L.a.Glu;b.blank;c.Na+;d.K+;e.Zn2+;f.Mg2+;g.Phe;h.Glycine;i.Ile;j.Thr;k.Asp;l.Try;m.Val;n.Ser.

2.6 实际样品分析

为验证方法的可行性，对人体血清中葡萄糖的含量进行了测定.取0.8 mL血清样品加入0.8 mL三氯乙酸（质量分数5%），在10000 r/min转速下离心10 min，去除血清蛋白.向反应体系中加入0.1 mL处理过的血清和不同浓度的葡萄糖，按1.3节步骤测定，结果见表2.样品检测液中葡萄糖浓度的比色法测定值分别为40.2和35.9μmol/L，根据稀释比，计算得出原样中葡萄糖的浓度分别为4.02和3.59 mmol/L，与临床测定结果（4.53和3.86 mmol/L）基本吻合，均在正常值范围内.此外，比色法与比率荧光法测定结果一致；回收率为93.3%～111.5%；RSD在0.4%～6.8%之间，说明方法的准确度和精密度高，可应用于实际样品分析.

Table 2 Detection of glucose in human serum*

3 结 论

以生物质（合果芋叶片）、含铁和含氮物质为起始物，制备了具有类过氧化物酶活性和荧光特性的双功能Fe，N-CDs.在Fe，N-CDs和OPD混合溶液中加入H2O2后，Fe，N-CDs能催化H2O2氧化OPD生成能发射荧光的DAP，DAP和Fe，N-CDs形成双发射体系，体系的相对荧光强度及DAP的吸光度受H2O2浓度的调节.结合葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生H2O2的原理，发展了一种比色/比率荧光双信号测定葡萄糖的分析方法.该方法具有灵敏度高、选择性好的特点，应用于人体血清中葡萄糖的测定，其结果与临床测定值相吻合.与已报道的双信号葡萄糖测定方法相比，本方法只需制备一种纳米材料.

支持信息见http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210019.