BSA-Gd2O3-HSP90靶向型纳米探针标记口腔鳞癌细胞及瘤体磁共振成像处理

林李芃，闫翔宇，袁峥鼎，戴家杰，濮芷青，徐凯，王永⋆

（1.徐州医科大学医学影像学院，江苏 徐州；2.徐州医科大学口腔医学院，江苏 徐州；3.徐州医科大学公共卫生学院，江苏 徐州；4.徐州医科大学附属医院 医学影像科，江苏 徐州）

0 引言

近年来，口腔鳞癌（Oral Squamous Cell Carcinomas,OSCC）的发病率不断增加，因其易发生区域淋巴结转移等疾患问题，预后相对较差。因此控制肿瘤细胞转移路径对该肿瘤的治疗和预后都起着重要作用。随着各类成像技术的发展，在衍生出的一系列非侵袭性检测手段中，分子影像动态监测更有助于明确目标肿瘤的转移路径和部位，从而清晰掌握口腔鳞癌动态治疗手段[1]。热休克蛋白（Heat Shock Protein, HSP）是一种能在体内特异性高表达的蛋白，主要在细胞分化及基因转录等方面发挥主要作用，又名“伴侣蛋白”。而其中热休克蛋白90（Heat Shock Protein 90,HSP90）又与肿瘤发展、转移及预后最具相关性，HSP90能较松弛地结合在肿瘤细胞细胞膜表面，靶向性指引肿瘤细胞迁移轨迹[2-3]。而在口腔细胞中，HSP90与口腔鳞癌细胞的分化增殖相关，可在其中高度特异性表达。在前期研究中我们可以证明BSA-Gd2O3能够作为可靠的磁共振成像（MRI）纳米探针载体，基于BSA-Gd2O3能够制备出可有效地标记肿瘤细胞的靶向型纳米探针[4]。

本实验在上述研究的基础上，运用BSA-Gd2O3对比剂与鼠抗人HSP90结合形成的纳米探针靶向示踪体外口腔鳞癌细胞，根据原始图像及Matlab7.0系统处理后图像成像效果对其示踪机制进行探讨，为以动物模型为基础的影像提取实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器及设备

主要包括：B13-3型磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司），HERACELL 150i二氧化碳培养箱（上海宝赛生物科技有限公司），L400台式低速自动平衡离心机（湘仪实验室仪器开发有限公司），DK-S24电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），电热恒温水温箱（北京医疗设备厂），电子天平BSM120.4（上海市卓精电子科技有限公司），3.0T全身磁共振成像设备（GE Discovery 750w，美国GE公司）等。

1.1.2 试剂

主要包括：新生牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），六水硝酸钆（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），PBS缓冲液粉末pH7.3（北京中山金桥生物科技有限公司），口腔鳞癌Cal-27细胞（上海中乔新舟生物科技有限公司），MEM基础培养基（上海中乔新舟生物科技有限公司），青霉素-链霉素溶液（上海碧云天生物技术有限公司），胰蛋白酶（上海碧云天生物技术有限公司），无血清冻存液（徐州微科曼得生物工程有限公司），HSP90抗体（鼠抗人热休克蛋白90，北京义翘神州生物技术有限公司），磷酸二氢钠（南京化学试剂有限公司）等。

1.1.3 耗材

主要包括：10 mL及50 mL离心管（美国Corning公司），3500Da透析袋美国SpectrumLabs公司，六孔培养板（美国Corning公司），巴氏管（美国Corning公司）培养瓶，EP管（美国AXYGEN公司），移液器枪头（美国AXYGEN公司）等。

1.2 制备BSA-Gd2O3磁共振纳米探针

按我们前期实验的方法[5]，称取BSA（牛血清蛋白）250 mg溶解于9 mL水中，缓慢加入1 mL 50 mol/L的六水硝酸钆后剧烈搅拌，5 min后加入1 mL 2 mol/L的氢氧化钠后剧烈搅拌，混合后置于37 ℃恒温水浴锅中水浴加热，同时在底部加入直径1 cm的磁珠后将其置于磁力搅拌器上以1200 r/min的速度剧烈搅拌12 h。充分反应后，将溶液倒入3500Da的透析袋中，将透析袋包被完整置于磁力搅拌器上以转速500 r/min搅拌30 h，分别间隔3 h、5 h、16 h后换水。透析后溶液体积由10 mL稀释为20 mL，从中取8 mL离心后取上清液分散于3.2 mL 20 mol/L的PBS（pH=7.4）缓冲液中，得到非均一的絮状乳白色沉淀。制备及储存过程中避光。将制备好的BSA-Gd2O3对比剂用3.0T磁共振扫描仪检测信号正常后置于4 ℃冰箱中备用。

1.3 Cal-27口腔鳞癌贴壁细胞模型建立

将复苏后的口腔鳞癌Cal-27细胞置于含10%胎牛血清的EME培养基中（含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），在37 ℃、5% CO2、相对湿度95%的条件下培养1周。待细胞贴壁密度达到80%后用0.25%胰蛋白酶消化，每3天传代1次，取对数生长期的细胞进行实验操作。

1.4 Cal-27细胞的体外对比剂靶向结合

将1 mg EDC、鼠抗人HSP90抗体与300 μL PBS缓冲液混合，37 ℃水浴加热15 min后加入1 mg NHS及500 μL传代后的口腔鳞癌Cal-27细胞并混合均匀，37 ℃水浴2 h后接种到6孔接种板上，设置孔板阶梯浓度分别为：0（空白对照组），10%，30%，50%，70%，100%，每孔加入 PBS缓冲溶液定容至500 μL，待充分混合1 h后用胰蛋白酶消化收集细胞，保存在浓度为35%的甲醛溶液中，检测口腔鳞癌细胞与HSP90抗体结合情况。

1.5 Cal-27瘤体MR成像及图像分析

将上述细胞悬液注入目标裸鼠体内后培养成瘤，置于3.0T全身磁共振成像设备下获取瘤体原始图像。应用Matlab7.0系统处理图像：首先读取原始MRI图像，对图像进行判断：如果为三通道的RGB图像，先进行图像灰度化。接着进行灰度反转、阴影滤波、平滑滤波、边缘增强、轮廓滤波。最后生成植入Cal-27细胞后的裸鼠MRI的T1横断面图像处理结果。

2 结果

2.1 图像处理效果比较

见图1、图2。

图1 未经处理的MRI T1横断面原始图像

图2 处理后的T1横断面（图像从左至右从上至下依次是原图像、灰度反转、阴影滤过、平滑滤波、边缘增强、轮廓滤波）

2.2 部分代码及说明

% 中值滤波来做图像平滑，滤波模板为3*3

I_medfilt = medfilt2(I_src,[3 3]);

subplot(2,3,4);

imshow(I_medfilt);

title('平滑滤波');

% canny边缘检测算子来进行边缘检测

I_canny=I_src;

BW1=edge(I_canny,'canny');

I_canny=double(I_canny);

g=[0-0.40;-17-1;0-0.40]/5;

m=filter2(g,I_canny);

k=0.9;

I_enhance = I_canny+k*m+double(BW1);

subplot(2,3,5);

imshow(uint8(I_enhance));

title('边缘增强');

BW2=edge(I_canny,'sobel');

[I_x,I_y]=gradient(double(I_canny));

I_gradient =I_x.*I_x+I_y.*I_y;

I_gradient =I_gradient+I_canny;

subplot(2,3,6);

imshow(I_gradient,[]);

title('轮廓滤波');

2.3 口腔鳞癌细胞的靶向磁共振信号表征

分别配制成钆离子浓度为 0、0.05、0.1、0.3、0.7、1 mmol/L的溶液，用3.0T Discovery 750w MRI测量不同浓度的T1弛豫时间，计算T1弛豫率。

扫描参数为：① 冠状位T1WI：TE=Out of phase，TR=16.0 ms，矩阵 =288×288，FOV=18 cm×18 cm，层厚 =1.0 mm。②轴位 T1WI：TE=Out of phase，TR=21.1 ms，矩阵=256×256，FOV=6 cm×6 cm，层厚=1.0 mm。

3 讨论

大量的探索和研究已经为磁共振示踪口腔鳞癌的临床应用奠定了基础，在临床治疗层面上，在体水平上图像示踪靶点的位置改变预示着临床应用上口腔鳞癌的不同分期，术中组织学和图像引导手术等发展目标是在手术过程中更准确地描绘肿瘤的边界，使肿瘤切除更加准确[6]。磁共振（MRI）已经成为肿瘤早期筛查及实验模型植入肿瘤示踪的利器，利用Matlab7.0对图像进行平滑滤波、边缘增强、轮廓滤波等操作，为磁共振图像提供更加直观的方位阅览。图中对比结果显示口腔鳞癌肿瘤的MRI处理图像明显好于原始图像，处理界面清晰，且肿瘤信号在靶向对比剂的引导下表达更为强烈，为临床诊断口腔鳞癌起到辅助作用。因此，如何更好地将纳米探针对比剂运用于体外目标细胞培养以及使用辅助性图像系统处理目标磁共振图像都是日后口腔鳞癌分子影像技术靶向示踪的重要研究方向。