不同炮制方法对雷公藤中雷公藤内酯甲和雷公藤甲素的影响

张奉苏，房克慧，陈宏降，田 静，张 柳，罗益远*

（1.扬州市食品药品检验检测中心，扬州225000；2.浙江医药高等专科学校中药学院，宁波315500；3.南京中医药大学，南京210023）

雷公藤（Tripterygium wilfordii）系卫矛科植物雷公藤的去皮根及根茎，又名黄藤、黄藤木、断肠草等。雷公藤首见于《本草纲目拾遗》，主产于福建、江西、湖北等地。具有祛风除湿、活血通络、消肿止痛、清热解毒功效，主要用于风湿顽痹、痈疮肿毒等病症治疗。化学成分主要包括二萜类、三萜类、生物碱类、倍半萜类以及糖类等[1-2]。现代研究表明雷公藤也具有多种药理活性，临床多用于治疗自身免疫性疾病及各种皮肤病，如类风湿关节炎、肾小球肾炎红斑狼疮等[3-4]，但是雷公藤的有效成分同时也是有毒成成分，临床观察中，雷公藤易发生胃肠道、血液和造血系统、生殖系统、肝脏、肾脏等多种器官发生的不良反应[4-7]。炮制是雷公藤提高药效、降低毒副作用且方便存储的方法。为了确保临床广泛而安全的用药，运用炮制方法对雷公藤进行增效减毒至关重要的[8-9]。雷公藤内酯甲和雷公藤甲素是雷公藤药材中的主要有效成分，且含量相对较稳定，目前多用作控制雷公藤药材质量的指标性成分[10-11]。本文在前期研究基础上[12]，以雷公藤药材及其不同炮制品为研究对象，建立同时测定雷公藤中雷公藤内酯甲和雷公藤甲素的分析方法，比较不同炮制方法对雷公藤中雷公藤内酯甲和雷公藤甲素含量的影响，及炮制前后雷公藤甲素和雷公藤内酯甲两组分的含量变化，以期为后续雷公藤减毒增效研究提供基础资料。

1 仪器和试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪、Agilent chemstation工作站（美国安捷伦公司）；KH-400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山禾利超声仪器有限公司）；十万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）；恒温水浴锅。

雷公藤内酯甲对照品（批号为LLH2-7RDS，纯度≥99%）购自于中国食品药品检定研究院，雷公藤甲素对照品（批号为111567-200502，纯度≥99%）购自于中国药品生物制品检定所；雷公藤（雷公藤去皮根药材、雷公藤根皮药材）于2016年采收于福建泰宁；甲醇为分析纯，三氯甲烷为分析纯，柱层析硅胶为60-100目，超纯水。

2 方法与结果

2.1 不同炮制品的制备

生品：取雷公藤药材，去根皮，切制成厚片，干燥；

炒炙：取雷公藤厚片置锅内，文火炒至有固有气味逸出，雷公藤厚片表面颜色加深，取出，干燥；

酒炙：称取雷公藤厚片100 g，置适宜容器中，加黄酒30 g拌匀，闷润2 h，置炒锅内，用文火炒干，取出，干燥；

醋炙：称取雷公藤厚片100 g，置适宜容器中，加米醋30 g拌匀，闷润2 h，置炒锅内，用文火炒干，取出，干燥；

蒸制：称取雷公藤厚片100 g，装入蒸锅内隔水蒸制4 h后取出，置烘箱内（40℃）烘干；

莱菔子汁煮：称取莱菔子10 g，加水分两次煎煮，过滤，合并滤液至200 mL；称取雷公藤厚片100 g置于锅内，倒入莱菔子汁，武火煮沸后文火煮至药透汁尽，取出，置烘箱内（40℃）烘干；

甘草汁煮：称取甘草10 g，加水分两次煎煮，过滤，合并滤液至200 mL；称取雷公藤厚片100 g置于锅内，倒入甘草汁，武火煮沸后用文火煮至药透汁尽，取出，置烘箱内（40℃）烘干；

水煮：称取雷公藤厚片置锅内，加水浸泡至内无干心，水没过药面，武火煮沸后用文火煮至内无白心，置烘箱内（40℃）烘干。

2.2 色谱条件

色谱柱：Inertstill ODS-SP柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：A为0.1%磷酸乙腈，B为0.2%三乙胺水溶液；梯度洗脱（0-15 min，10%-33%A；15-22 min，

33%-33%A；22-30min，33%-50%A；30-40 min，50%-85%A；40-55 min，85%-95%A；55-60 min，95%-95%A；60-65 min，95%-10%A）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。对照品与样品的HPLC色谱图见图1。

注：1-雷公藤甲素（Triptolide）；2-雷公藤内酯甲（Wilforlide A）

2.3 混合对照品溶液制备

精密称取雷公藤内酯甲14.26 mg，雷公藤甲素12.26 mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀即得。其中雷公藤内酯甲浓度为285.2μg/mL、雷公藤甲素浓度为245.2μg/mL。

2.4 供试品溶液制备

将各雷公藤样品干燥粉碎（过40目筛），分别取约15g，精密称定，加甲醇水浴回流提取2次每次60 mL，过滤，合并滤液，浓缩至5mL，用硅胶拌样，取8.0 g硅胶干法装柱（10 cm×1.5 cm）上柱，氯仿-甲醇（97∶3）50 mL洗脱，洗脱液浓缩至干后用甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.5 标准曲线、检出限及定量限

精密量取“2.3”项下的混合对照品溶液0.5、2、3、4、5mL分别置于20mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；另取混合对照品溶液，按“2.2”项下的色谱条件，分别进样20μL。以峰面积（y）为纵坐标，对照品浓度（x）为横坐标绘制标准曲线方程，得回归方程及线性范围见表1。以各化合物3倍信噪比计算各组分的检出限；以各化合物10倍信噪比计算各组分的定量限。

表1 标准曲线、检测限（LOD）和定量限（LOQ）Table 1 Calibration cure and results of LOD and LOQ

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度、稳定性、重复性试验

量取“2.3”项下的混合对照品溶液20μL，连续进样6次，测定并记录雷公藤内酯甲峰和雷公藤甲素峰的峰面积，计算其RSD分别为1.1%和1.2%，表明仪器的精密度良好；取雷公藤生品供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h分别进样，记录雷公藤内酯甲峰和雷公藤甲素峰的峰面积，计算其RSD分别为0.8%和1.0%，表明供试品溶液在24 h内较稳定。取雷公藤生品粉末6份，精密称定，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，测定并记录雷公藤内酯甲峰和雷公藤甲素峰的峰面积，计算其RSD分别为0.7%和0.9%，表明该方法重复性良好。

2.6.2 加样回收试验

取已知含量的雷公藤莱菔子汁煮供试品溶液9份，精密称定，各加入适量的雷公藤内酯甲对照品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液；同法制备雷公藤甲素的供试品溶液，测定并计算供试品溶液中对照品的含量，计算平均加样回收率和RSD值，结果见表2。

表2 方法学测定结果Table 2 Results of methodological

2.7 样品测定

取雷公藤生品、根皮和7个炮制品，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定。按外标法计算（以干燥品计）得生品、根皮及各炮制品中雷公藤内酯甲和雷公藤甲素的含量，结果见表3。

表3 雷公藤不同炮制品中雷公藤内酯甲和雷公藤甲素的测定结果（μg/g，n=3）Table 3 Content of Triptolide and Wilforlide A in different samples(μg/g，n=3)

3 小结与讨论

3.1 色谱条件优化

在本实验考察了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.2%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，0.1%磷酸乙腈-0.2%三乙胺水溶液梯度洗脱等多种流动相组成，结果表明0.1%磷酸乙腈-0.2%三乙胺水溶液梯度洗脱较其他几种流动相有较好的分离度，峰对称性较好。采用等度洗脱难以将两种指标成分良好分离，因此采用梯度洗脱法，并且考察不同的洗脱程序。

3.2 样品制备方法确定

对雷公藤内酯甲和雷公藤甲素的提取纯化工艺进行了探究及优化，考察了5种提取纯化工艺：甲醇超声提取30分钟、氯仿超声提取30分钟、甲醇回流提取2次-硅胶柱纯化、甲醇回流提取2次-硅胶拌样-氯仿超声、甲醇回流提取2次-硅胶拌样-氯仿超声-硅胶柱纯化。结果显示直接用甲醇回流提取后经硅胶柱纯化，待测组分的提取效果较差，分离效果不理想；甲醇回流后，硅胶拌样用氯仿超声提取，提取效果同样不理想，若未经硅胶柱纯化，易污染液相色谱柱，且分离效果不佳。因此笔者选用甲醇回流提取2次-硅胶拌样-氯仿超声滤取-硅胶柱纯化。同时对采用硅胶柱纯化时的硅胶用量进行了考察：分别取4、6、8、10 g硅胶对同一样品进行分离纯化，最终发现硅胶取样量为8 g时分离纯化效果最好，且分离效率较高。

3.3 实验结果分析

雷公藤内酯甲和雷公藤甲素是雷公藤药材中的主要有效成分，且含量相对较稳定，目前多用于雷公藤药材质量控制的指标性成分。本实验采用反相高效液相色谱法有效的实现了这两种有效成分的良好分离，较准确地测定其在不同炮制品中的含量。结果表明，不同炮制品中这两种有效成分的含量较生品都有所降低，其中雷公藤甲素的变化较雷公藤内酯甲的变化大，酒炙品和醋炙品中雷公藤内酯甲含量降低较明显，醋炙品、酒炙品和清炒品中雷公藤甲素的含量变化较大，相比较而言，莱菔子汁煮品和蒸制品对雷公藤中主要成分含量影响较小。实验结果表明，雷公藤根皮生品中雷公藤内酯甲的含量明显高于雷公藤药材中，进一步表明，雷公藤根皮毒性高于雷公藤药材，不同的炮制方法对其指标性成分的降低有一定的作用。

本实验建立高效液相色谱发法同时测定不同雷公藤炮制品中雷公藤内酯甲和雷公藤甲素的含量进行比较分析。该方法简单、准确、重现性好，为雷公藤药材内在质量的综合评价和全面控制提供可靠的检测方法。就本实验而言，采用不同的炮制方法对雷公藤主要有效成分的含量有一定影响，酒炙的方法可以同时明显降低生品中雷公藤甲素和雷公藤内酯甲的含量，其次是醋炙和甘草汁煎煮。