葡萄籽提取物缓解砷中毒氧化应激的作用研究进展

王泽兰 王亚洁

葡萄籽提取物是从葡萄籽中提取分离得到的一类多酚类物质，广泛存在于植物性食物中，主要由原花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯等多酚类物质组成。葡萄籽提取物是纯天然物质，也是迄今发现的植物来源最高效的抗氧化剂之一，其抗氧化效果是维生素C和维生素E的30-50倍，可以通过多条途径及多种分子机制表现出抗炎、抗氧化应激、抗凋亡等生理功能。

砷是元素周期表中的第33个元素，具有金属和非金属的特征，因此被称为类金属，可以来自自然和人为的土壤、水和空气。随着科技的发展，砷被广泛用于化妆品、木材防腐剂、棉花干燥剂、杀虫剂等多领域，甚至被用于治疗急性早幼粒细胞白血病。从生物学和毒理学角度，砷化合物分为无机砷化合物、有机砷化合物和砷气，其中无机砷主要包括三氧化二砷、亚砷酸盐、三氯化砷等三价砷，以及五氧化二砷、胂酸、砷酸盐等五价砷；常见的有机砷包括对氨基苯胂酸、一甲基胂酸、二甲基胂酸、砷甜菜碱。

砷暴露会诱导细胞内活性氧产生，通过改变信号通路和表观遗传修饰对细胞进行多种改变，或对分子直接造成氧化损伤。长期砷暴露与多种疾病有关，例如癌症、呼吸系统疾病、心血管疾病、糖尿病、肾脏疾病等。由于饮用水中无机砷的污染，致使全世界超过1.4亿人的健康受到威胁，因此砷中毒是一个全球性的健康问题。

砷的毒性机制很复杂，目前尚未完全了解，由活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的氧化应激是砷的共同毒性特征，而葡萄籽提取物中富含的多酚类物质具有显著改善氧化应激的作用。ROS包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧、过氧自由基等，在砷中毒中主要参与的ROS途径包括Nrf2-抗氧化反应元件信号通路、微小脱氧核糖核苷酸、线粒体自噬途径、酪氨酸磷酸化系统、丝裂原活化蛋白激酶、核因子NF-κB等。本文介绍了参与砷诱导的氧化还原途径，希望为葡萄籽提取物应用于砷中毒的预防和治疗提供新思路。

一、Nrf2-ARE途径

核转录因子E2相关因子（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是抗氧化系统中的主要转录因子，在生理条件下Nrf2的蛋白质表达水平较低，与Kelch样ECH相关蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）形成E3泛素连接酶复合物，随后被Nrf2降解。当机体产生过量的ROS，Keap1中的某些半胱氨酸残基（C273、C288和C151）被S-烷基化，导致Keap1介导的Nrf2降解受损。然后Nrf2在细胞质中积累、在细胞核中易位，与小分子形成二聚体并激活抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）依赖的基因表达。研究表明，葡萄籽提取物中丰富的原花青素能够上调Nrf2及下游基因的mRNA水平，还能够使Nrf2及下游相关蛋白含量上调，从而使SOD、GSH、GSHPX、T-AOC的水平上升，进而降低MDA含量以缓解机体的氧化应激状态。因此，Nrf2-ARE途径的作用在葡萄籽抑制砷毒性的研究中引起了广泛的关注。

二、microRNAs

表观遗传修饰通过砷暴露导致毒性作用，主要通过修饰miRNAs，并且与细胞内的ROS水平密切相关。研究发现，慢性砷暴露导致ROS过量产生，从而诱导激活miR-199a-5p/缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/环氧合酶-2（COX-2）通路。机体过量的ROS通过增加miR-199a基因的启动子甲基化，从而抑制miR-199a的表达。在砷诱导的恶性转化中，并非miRNA的所有改变都与ROS有关。研究发现，在人支气管上皮细胞（16-HBE）中，miR-155通过诱导Nrf2导致亚砷酸盐诱导的恶性转化，但通过二氯二氢荧光素测定，在砷转化细胞中ROS的产生并没有发生显著变化。ROS的水平可以由miRNA调节，如在脑缺血、脊髓缺血/再灌注损伤等疾病中，miRNA-20b过表达增加了5三磷酸腺苷（ATP）的水平和ROS在SD大鼠脑缺血中的作用，而抑制miRNA-20b则降低了ROS的水平。miR-451过表达降低了细胞凋亡率，枸杞多糖可以通过下调PC-12细胞中miR-194的诱导，从而降低ROS和NO的水平。

了解砷诱导毒性的分子机制，例如ROS的生成动力学、miRNA表达以及ROS和miRNA之间的关系，可以为抗砷毒性战略提供新思路。然而到目前为止，只有少数研究涉及砷毒性的分子机制探索，未来需要着重了解ROS改变与miRNA表达之间的潜在关系，其中研究ROS在表观遗传失调中的作用将成为重中之重。

三、线粒体自噬

线粒体作为组织内稳态必不可少的能量发生器以及程序性凋亡和坏死细胞死亡的通道，其质量和数量受到严格控制。线粒体自噬（Mitophagy）是细胞自噬装置对线粒体的靶向吞噬和破坏，通常被认为是线粒体质量控制的主要机制。线粒体是ROS产生和释放的主要场所，中度活性氧线粒体自噬对细胞增殖和存活至关重要，然而ROS水平过高则可诱导细胞凋亡，此外线粒体中不断产生的ROS可导致细胞自噬、凋亡或坏死。一方面，砷具有线粒体毒性，导致线粒体肿胀和嵴碎裂，扰乱呼吸复合体，并产生ROS；另一方面，过量的ROS生成会导致线粒体功能障碍。葡萄籽提取物对线粒体损伤具有保护作用，研究显示，葡萄籽低聚原花青素通过线粒体糖代谢酶途径，对顺铂导致的人胚肾细胞线粒体损伤具有保护作用。

线粒体自噬是细胞内一种重要的选择性自噬，可以有效清除机体细胞内由各种原因所产生的受损线粒体，维持细胞的能量和物质代谢，保持细胞正常的功能状态。目前已知调控哺乳动物中线粒体自噬的机制主要有两种：一种是parkin（E3 ubiquitin-protein ligase parkin）依赖性的，即线粒体外膜蛋白PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）介导的线粒体自噬；另一种是parkin非依赖性的，包括缺氧介导的线粒体自噬及Bnip3/Nix介导的线粒体自噬。近几年的研究表明，PINK1和parkin是调控线粒体自噬的重要组分，有助于维持线粒体的正常功能。

由于对潜在致病机制的不完全了解，砷中毒的有效预防和治疗策略在全球范围内仍是一个挑战，ROS改变则是公认的砷毒性中的关键事件。氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。早期急性暴露和相对高剂量砷的研究表明，过量的ROS会干扰细胞信号通路以及损伤大分子，但现实环境中ROS的机制和功能可能有所不同，长期低剂量砷暴露也会影响数百万人的健康。此外，砷的体外暴露测定浓度可能会影响潜在的体内毒性生物分子效应，从而使用于风险评估的剂量反应数据缺失。

我国植物性食物来源丰富，其中富含有益于身体健康的营养物质，以及具有一定生理功能的植物化学物。大量研究显示，葡萄籽提取物原花青素能够特异性附着在内皮细胞表面，清除胞外有害自由基，保护心血管；能够抵抗各种化学药物对各脏器的毒性作用；能够损伤肿瘤细胞线粒体，激活caspases并干扰促有丝分裂信号激活JNK，诱导肿瘤细胞凋亡；能够增强血管表皮生长因子的表达，促进伤口愈合，并能增强纤维原细胞的迁移和增殖，促进组织修复；能够抑制趋化受体的表达，抵抗HIV感染等多種生物药理活性。如何充分发挥这类物质的功效，使其在人类亚健康的改善及常见慢性病的预防甚至治疗等领域充分发挥功效，成为现今关注的热点。因此，葡萄籽提取物在砷毒性中缓解氧化应激的重要作用的阐明，将会为疾病的预防与治疗提供新思路与新策略。