荜茇细粉混悬液的安全药理学研究

胡玉霞，李君，王敏杰，白图雅，吕晓丽，张梦迪，高峰，王跃武，张谦，常福厚*（1.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，呼和浩特 010110；2.内蒙古自治区新药筛选工程研究中心，呼和浩特 010110；3.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110；4.内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特 010110）

荜茇（Piper longumL.）属于胡椒科胡椒属植物荜茇的干燥未成熟或成熟的果穗，别名荜拨、派珀茇、毕勃、荜菝[1]。荜茇在中医和蒙医的临床应用各有特点，配伍及治疗疾病也有较大差异。中医强调荜茇温中散寒、下气止痛的功效，主要用于治疗胃寒或胃冷引起的腹痛、腹泻及消化不良，亦可治疗胸腹痛、冠心病、心绞痛、神经性头痛及牙痛等[2]，但中医临床较少应用。荜茇蒙医应用广泛，《内蒙古蒙成药标准》记载的103 个成方用荜茇共27 次[3]，蒙药临床常用的1011 个方剂有195 个包含荜茇[4]。蒙医药认为，荜茇味辛，性温，效腻、锐、轻、燥，有调理胃火、祛“巴达干、赫依”、调节体素、滋补强壮、平喘、止痛等功效[5]。

现代药理学研究发现，荜茇含生物碱类、萜类、挥发油类、甾醇类、木质素类等50 多种有效成分，其中生物碱类化合物多达40 余种，包括胡椒碱、荜茇宁碱等，为目前已知荜茇的主要化学成分[6]，具有调血脂、抗肿瘤、抗氧化、保肝、抗炎、镇痛、抗菌等作用[7]。荜茇作为一种传统的民族药材，具有丰富的药用价值。

目前荜茇的安全性评价研究多集中在急性毒性和长期毒性研究，安全药理学研究鲜有报道。为了进一步明确荜茇的安全性，参考国家《药物安全药理学研究技术指导原则》[8]的相关技术要求，本文观察荜茇对实验动物中枢神经系统和心血管系统的影响，以补充和完善荜茇的安全性数据，为日后建立蒙药毒性筛选库提供依据。

1 材料

1.1 试药

荜茇饮片（东营百佳益中药饮片有限公司，批号：20180325；产地：山东潍坊，经内蒙古医科大学生药教研室渠弼鉴定为正品）。称取适量荜茇饮片，用粉碎机进行粉碎，过100 目筛，即得荜茇细粉。称取适量荜茇细粉于配药瓶中，加入总体积70%左右的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，先用玻璃棒搅拌溶解后定容至终体积，再用数控超声波清洗器100 Hz 振荡10 min，得荜茇细粉混悬液，备用。

羧甲基纤维素钠（天津光复精细化工研究所，批号：20180118）；异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批号：217171101）；生理盐水（山东华鲁制药有限公司，批号：D16070503）；戊巴比妥钠（上海榕柏生物技术有限公司，批号：20170916）；无水乙醇（天津市津东天正精细化学试剂厂，批号：20180317）。

1.2 动物

1.2.1 动物来源 ICR 小鼠，SPF 级，80 只，雌雄各半，体质量：20.0～22.0 g [北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK（京）2012-0001]。SD 大鼠，SPF 级，40只，雌雄各半，体质量：190.0～210.0 g [北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK（京）2012-0001]。Beagle 犬，普通级，6 只，雌雄各半，体质量：9.05～12.15 kg [北京玛斯生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0001]。

1.2.2 饲养管理 ICR 小鼠和SD 大鼠饲养于内蒙古医科大学新药安全评价研究中心屏障设施内[实验动物使用许可证号：SYXK（蒙）2014-0003]。PVC 塑料盒饲养，一盒5 只。60Co 放射灭菌SPF 级大小鼠生长繁殖饲料。每日上、下午定量给食，自由摄取，自由进水。

Beagle 犬饲养于内蒙古医科大学新药安全评价研究中心普通设施内[实验动物使用许可证号：SYXK（蒙）2014-0003]。动物单笼圈养，每日上、下午定量给食，自由摄取，自由进水。

1.3 仪器

植入式生理信号遥测系统（美国Data Sciences International 公司）；动物麻醉机（VME2，美国Midmark 公司）；小动物活动记录仪（YLS-1C）、大小鼠转棒测试仪（YLS-31A）（山东益延科技有限公司）；数控超声波清洗器（KH-500DV，北京晨曦勇创科技有限公司）；粉碎机（DSY350，上海市顶帅工贸有限公司）；分析天平（BSA4202s）、电子天平（BSA224s）（赛多利斯科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 心血管系统实验

ECG 采用标准Ⅱ导联的方式放置，胸右侧2～3 肋间隙与锁骨中线相交处为负极，胸左侧12～13 肋骨体与腋中线相交处为正极。呼吸电极由4 条导线组成，正极导线和负极导线各2 条，2 条正极导线放置在胸左侧第7 肋骨前后，相距2.5 cm，而2 条负极导线放置在胸右侧第7 肋骨前后，相距2.5 cm，通过检测呼吸阻抗的值，确定呼吸电极放置得是否合适。手术全程通过植入式大动物生理信号遥测系统和VME2 型麻醉机（通过观察气囊的变化检测呼吸频率）实时监测动物状态。动物手术后进入手术恢复期，恢复期为4 周。

选用已经埋入植入子（TL11M3-D70-PCTR）的健康Beagle 犬6 只，雌雄各半。实验设溶媒对照组及荜茇细粉低、中、高剂量组，分别为0.1、0.3、0.9 g·kg－1（相当于临床成人用药剂量的3、10 和30 倍）。实验设4 个给药周期，相邻给药周期间隔为7 d。灌胃给药，给药体积为10 mL·kg－1。

待全部动物恢复好后，利用植入式生理信号遥测系统的Ponemah 软件操作平台（版本5.0）采集动物心电、血压、体温等指标。心电指标包括心率、PR 间期、QRS 间期、QT 间期、P 波、R 波、ST 段（取绝对值进行统计）、T 波，血压指标包括收缩压、舒张压、平均压。采集给药前2 h 及给药后24 h 数据。采集间隔为每10 s 系统自动记录一次。统计时选取给药前30 min 的时间点为给药前基础值、记录给药后0.5、1、2、3、4 h 的连续数据。剔除因动物躁动等因素导致的数据丢失和大幅度偏移的数据，取每个时间点后5 min数据的平均值作为该时间点数据。

2.2 中枢神经系统实验

2.2.1 对小鼠自主活动的影响实验 选取ICR 小鼠40 只，根据中心SOP 规定按体质量随机分为4 组，每组10 只，分别为溶媒对照组，荜茇细粉低、中、高剂量组（0.52、1.56、4.68 g·kg－1，相当于临床成人用药剂量的17、52 和156 倍）。分别经口灌胃给予相应供试品，给药体积为10 mL·kg－1。于给药前30 min 及给药后30 min、1 h、2 h、3 h、4 h 时间点放入小动物活动记录仪的活动箱中，测定各鼠活动情况，记录10 min 内的自主活动次数。

2.2.2 对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠的影响实验 选取ICR 小鼠40 只，根据中心SOP 规定分为4 组，每组10 只，分别为溶媒对照组，荜茇细粉低、中、高剂量组。于给药后6 h 腹腔注射30 mg·kg－1戊巴比妥钠，注射体积均为10 mL·kg－1（质量浓度为3.0 mg·mL－1），即刻开始观察注射戊巴比妥钠30 min 内每组翻正反射消失达1 min 以上的动物数，凡30 min 内动物翻正反射消失达1 min 以上者，表明发生了睡眠，翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间。记录每组发生睡眠的小鼠数和入睡潜伏期、睡眠时间。

2.2.3 对大鼠协调运动的影响实验（转棒法） 选取检疫合格的SD 大鼠置于大小鼠转棒测试仪的滚筒上训练，转速为12 r·min－1。训练结束后，选取能在转棒仪滚筒上维持3 min 以上不掉落的大鼠40 只，雌雄各半，按潜伏期（从转棒仪滚筒上掉落所用时间）随机分为4 组，每组10 只，分别为溶媒对照组，荜茇细粉低、中、高剂量组（0.52、1.56、4.68 g·kg－1，相当于临床成人用药剂量的17、52 和156 倍）。分别经口灌胃给予相应供试品，给药体积为10 mL·kg－1。分别于给药后1、2、3、4 h 时间点将大鼠放在转棒仪滚筒上，记录每只大鼠从转棒仪滚筒上掉落所用时间（即潜伏期），若10 min 以上不掉落则以10 min 计。

2.3 数据处理及统计分析

按照中心SOP 规定进行统计学分析，所用软件为SPSS 20.0。计量资料采用±s表示，用Levene’s test 方法检验方差齐性。方差齐，用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，两两比较采用LSD test（参数法）进行比较分析；方差不齐，则用Kruskal-Wallis 检验，两两比较采用Dunnett’s Test（非参数方法）进行比较分析。计数资料用频数表示，采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 心血管系统的影响

3.1.1 对清醒Beagle 犬心电指标的影响 结果显示给药前各剂量组所有心电指标（心率、PR 间期、QRS 间期、QT 间期、P 波、T 波、R 波及ST 段）均无明显差异。荜茇细粉在给药后心电指标见表1。与溶媒对照组在同一检测时间点的QT 值相比，给予高剂量组荜茇细粉混悬液2 h 后，动物心率降低（P＜0.05），QT 间期出现延长（P＜0.05）。给药后3 h，心率恢复正常，QT 值恢复正常。

表1 荜茇细粉对Beagle 犬心率和QT 间期的影响(±s，n＝6)Tab 1 Effect of piper longum fine powder on the heart rate and QT interval of Beagle dogs (±s，n＝6)

表1 荜茇细粉对Beagle 犬心率和QT 间期的影响(±s，n＝6)Tab 1 Effect of piper longum fine powder on the heart rate and QT interval of Beagle dogs (±s，n＝6)

注：与溶媒对照组比较，*P＜0.05。Note：vs the solvent control group，*P＜0.05.

组别 标准Ⅱ导联 采集时间给药前30 min 给药后30 min 给药后1 h 给药后2 h 给药后3 h 给药后4 h溶媒对照组 心率/BPM 102.62±10.22 114.56±36.72 95.37±9.68 96.24±15.28 95.23±24.38 98.72±19.23 QT 间期/ms 217.32±27.84 213.54±21.46 220.57±23.42 216.72±25.53 220.52±29.78 228.49±25.47低剂量组 心率/BPM 99.09±20.53 109.53±28.47 115.36±49.45 93.46±15.27 89.52±12.53 92.33±15.67 QT 间期/ms 209.31±17.52 206.37±19.87 209.64±26.34 221.34±18.64 215.49±24.76 230.17±19.28中剂量组 心率/BPM 98.76±17.96 117.44±27.38 98.75±40.35 88.92±15.01 89.58±18.73 90.40±7.62 QT 间期/ms 214.75±28.51 215.37±26.72 210.38±25.76 225.63±28.35 230.96±24.51 218.79±17.64高剂量组 心率/BPM 107.38±27.54 99.50±10.19 105.63±35.67 68.25±7.45* 82.36±16.81 90.87±13.28 QT 间期/ms 209.38±27.63 218.17±19.40 213.72±27.51 273.38±30.27* 235.82±28.91 235.68±24.22

3.1.2 对清醒Beagle 犬血压的影响 Beagle 犬灌胃给予荜茇细粉混悬液后，对各组清醒Beagle 犬的血压进行检测，结果显示：与溶媒对照组动物在同一检测时间点的数值相比，各实验组动物收缩压、舒张压和平均压在所有检测时间点均未见明显改变，差异无统计学意义。

3.1.3 对清醒Beagle 犬体温的影响 比格犬灌胃给予荜茇细粉混悬液后，对清醒Beagle 犬的体温进行检测，结果显示：给药前所有动物体温均在正常体温范围内（37.1～38.2℃）波动，给药后，与溶媒对照组动物在同一检测时间点的数值相比，不同实验组之间未见明显差异。

3.2 中枢神经系统的影响

3.2.1 自主活动的影响 如表2所示，与溶媒对照组比较，荜茇细粉高剂量组动物给药30 min、1 h 后活动次数明显减少（P＜0.01）；其他各检测点活动次数均未见明显差异。

表2 荜茇细粉对小鼠自主活动的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of piper longum fine powder on the spontaneous activity of mice (±s，n＝10)

表2 荜茇细粉对小鼠自主活动的影响(±s，n＝10)Tab 2 Effect of piper longum fine powder on the spontaneous activity of mice (±s，n＝10)

注：与溶媒对照组比较，*P＜0.01。Note：vs the solvent control group，*P＜0.01.

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3.2.2 对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠的影响 如表3所示，与溶媒对照组比较，睡眠潜伏期、睡眠时间各组均无明显差异。

表3 荜茇细粉对小鼠睡眠潜伏期及睡眠时间的影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of piper longum fine powder on the sleep latency and sleep duration of mice (±s，n＝10)

表3 荜茇细粉对小鼠睡眠潜伏期及睡眠时间的影响(±s，n＝10)Tab 3 Effect of piper longum fine powder on the sleep latency and sleep duration of mice (±s，n＝10)

组别 入睡潜伏期/min睡眠时间/min 入睡只数/只睡眠率/%溶媒对照组 7.50±1.05 8.59±1.20 3 30.0低剂量组 6.52±0.57 10.35±0.82 4 40.0中剂量组 5.83±0.49 9.75±0.55 3 30.0高剂量组 6.42±0.73 8.49±0.76 4 40.0

3.2.3 对大鼠协调运动的影响（转棒法） 如表4所示，荜茇细粉中剂量组在给药30 min、1 h 后的运动潜伏期减少，荜茇细粉高剂量组在给药30 min、1 h、2 h、3 h 后的运动潜伏期减少，但与溶媒对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。其他各检测点运动潜伏期均未见明显差异。

表4 荜茇细粉对大鼠协调运动的影响(s，±s，n＝10)Tab 4 Effect of piper longum fine powder on the rota-rod test of rats (s，±s，n＝10)

表4 荜茇细粉对大鼠协调运动的影响(s，±s，n＝10)Tab 4 Effect of piper longum fine powder on the rota-rod test of rats (s，±s，n＝10)

组别 采集时间给药前30 min 给药后30 min 给药后1 h 给药后2 h 给药后3 h 给药后4 h溶媒对照组 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00低剂量组 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00中剂量组 600.00±0.00 588.70±35.73 590.50±46.62 600.00±0.00 600.00±0.00 600.00±0.00高剂量组 600.00±0.00 557.30±45.33 572.20±37.91 580.60±41.59 594.20±18.34 600.00±0.00

4 讨论

安全药理学主要观察药物对中枢神经系统、呼吸系统、心血管系统3 个方面的影响，属于新药安全性评价范畴，既可以在临床前阶段发现该药物除主要药效作用之外的其他药理作用，也可以预测药物发生不良反应的范围和概率，为药物最终用于临床提供依据。由于技术所限，以往采用麻醉动物进行心血管系统相关指标的测定，但麻醉药物可能会影响受试物的作用，干扰对结果的评价。遥测技术的成熟应用成功解决了上述问题，已经成为安全药理学研究的常规技术[9]。本实验分别通过对不同种属（啮齿类和非啮齿类）动物给予荜茇细粉混悬液后进行安全药理学研究，多方面、多角度提供数据，有助于加深对受试物药理毒理作用的判断[10]。

现代药理学研究表明，荜茇具有抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗炎、免疫调节、扩张冠状动脉血管、抗菌、抗血小板、抗高血脂、减肥、止痛、保护心肌、抗真菌等多种药理学作用。文献报道胡椒碱和荜茇提取物在体内外均对道尔顿腹水瘤具有抑制作用。荜茇提取物（10 mg·kg－1）和胡椒碱（1.14 mg·kg－1）均可以抑制道尔顿淋巴瘤在小鼠体内的进程，延长小鼠寿命[11]；另外250 μg·mL－1胡椒碱对道尔顿淋巴瘤和埃利希腹水癌细胞具有细胞毒性[12]。研究发现200、400 及800 mg·kg－1荜茇根粉末水悬液灌胃给予小鼠或大鼠评价其止痛作用。400 及800 mg·kg－1的荜茇粉末与非甾体抗炎药的止痛作用相似[13]。然而，对于其安全性的研究却很少。有报道在急性毒性实验中，没有发现胡椒碱有致死作用，并且在药理药效研究中给予受试动物3～5 mg·kg－1剂量条件下，没有观察到任何病态症状[14]。

在本研究中，通过对Beagle 犬和ICR 小鼠及SD 大鼠单次灌胃给药进行安全药理学研究，观察该药对Beagle 犬心血管系统和ICR 小鼠及SD大鼠中枢神经系统的影响，探讨给予荜茇后有无可能出现非期望的药理作用[15]。动物选择应与实验方法相匹配，一般来说观察药物对神经系统的反应采用小鼠进行研究，但小鼠体型较小，现有实验技术很难对其心血管系统进行评价，故首选Beagle 犬开展心血管系统实验[16]。

心血管系统实验研究结果表明，Beagle 犬单次灌胃给予荜茇细粉混悬液0.1 和0.3 g·kg－1，未观测到清醒Beagle 犬心电指标的明显变化。高剂量荜茇细粉混悬液2 h 后，动物心率出现降低（P＜0.05）；在给药后3 h 恢复正常。荜茇细粉混悬液高剂量动物在给药后2 h，QT 间期出现延长（P＜0.05），在给药后3 h 恢复正常。各实验组清醒Beagle 犬的收缩压、舒张压和平均压均未见明显改变，说明荜茇在临床上的用量对心电和血压指标无明显影响。由于动物顺应性不同，不同动物检测过程中精神紧张程度及配合程度均有差异，致使心电、血压检测指标有一定程度的波动，但未出现一定的趋势。结合动物一般反应情况，认为这些波动的出现是动物正常的生物学差异，与药物无关。

中枢神经系统实验研究结果表明，ICR 小鼠单次灌胃给予荜茇细粉0.52 和1.56 g·kg－1，未观测到小鼠活动次数的明显变化，单与同期溶媒对照组比较，荜茇细粉高剂量组动物给药后30 min、1 h 活动次数明显减少（P＜0.01）。研究发现各剂量组ICR 小鼠均未见与阈下剂量戊巴比妥钠协同睡眠作用。SD 大鼠单次灌胃给予荜茇细粉混悬液后各剂量组动物的协调运动能力未见明显变化。

本研究表明荜茇对心血管系统和中枢神经系统均无明显影响，为荜茇在临床应用和新药开发方面提供了一定的动物实验依据。